豬油是世界上產(chǎn)量最多的油脂，豬油主要由棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸及亞麻酸等4種脂肪酸組成。豬油價格便宜，在畜禽生產(chǎn)中為降低成本經(jīng)常被使用。豬油能為畜禽生長提供足夠的能量、改善飼料適口性、改善飼料外觀特性、提高其他營養(yǎng)成分吸收利用。在炎熱的夏季，添加適量豬油，可以起到抗熱應激作用。但豬油的品質(zhì)比較難控制，現(xiàn)在使用豬油的比例逐年減少。
本文從反應溫度、緩沖液/豆油摩爾比、pH值、脂肪酶的用量等方面研究了脂肪酶對豬油的催化性能，得到了豬油體外酶解反應的適宜條件，為脂肪酶催化水解法制備脂肪酸的生產(chǎn)工藝提供了技術(shù)支持。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
豬油：由市場上購買的一般食用豬油，主要成分見表1。
脂肪酶：從市場上A公司購買，由米曲霉發(fā)酵生產(chǎn)的脂肪酶。
1.2 試劑及儀器
無水乙醇、乙醚均為分析純；10mg/mL酚酞乙醇溶液；0.1mol/L KOH標準溶液；電動攪拌機；離心機；精密天平；電熱振蕩恒溫水浴鍋。
1.3 試驗方法
1.3.1 酶促水解豬油的操作方法
將豬油與水按一定比例混合，用電動攪拌機進行攪拌混合（攪拌3min，停5min，再攪拌3min，以此重復）。把攪拌好的混合液放到45℃水浴鍋中，快速加入定量脂肪酶，同時振蕩計時。
1.3.2 緩沖溶液
緩沖溶液是濃度為0.2mol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液，調(diào)成不同的pH值。
1.3.3 豬油酶解條件的確定
1.3.3.1 酶解時間的確定
水加豬油分別按60︰1、50︰1、40︰1混合，加入10%的脂肪酶，在pH值為7.5，溫度為45℃條件下水解，每隔1h測定水解產(chǎn)物的酸值，確定水解時間。
1.3.3.2 最佳水解條件的確定
為了確定豬油最佳的水解條件，以酶解溫度、底物摩爾比、加酶量、pH值做四因素三水平正交試驗，不考慮交互作用。見表2。
1.4 分析方法
1.4.1 酸值: 根據(jù)GB/T 5530-199測定。
1.4.2 皂化值: 根據(jù)GB/ T5534-1995測定。
1.4.3 水解轉(zhuǎn)化率:x（%）=AV/SV X100式中：AV-反應過程中酸值，mgKOH/g；SV-豆油的初始皂化值，mgKOH/g。
2 結(jié)果與討論
2.1 酶解時間對豬油水解效果的影響
在豬油中添加10%的脂肪酶，在pH值為7.5，溫度為45℃的條件下，改變豬油和水的比例，確定豬油最佳的水解時間。不同酶解時間豬油酸值變化如表3所示。
由表3可知，無論反應物的摩爾比是多少，它們的變化都有一個相同的趨勢，即隨著時間的增加，水解率也會提高。但是，到了8h時，水解率的變化幅度不大，跟反應7h時的水解率趨于一致，甚至出現(xiàn)下滑的現(xiàn)象。可知，水解時間達到7h后，豬油水解趨于平衡。由此確定最佳反應時間為7h，故以下的水解時間都為7h。
2.2 豬油酶解條件的確定。
不同酶解條件的正交試驗結(jié)果見指標趨勢圖1。
對因素A而言，溫度對脂肪酶促油脂水解反應的影響較復雜，溫度升高對酶促反應產(chǎn)生兩種相反的效果。一方面，升高溫度可以增加水和油脂的互溶度，增強混合物的流動性，減小傳質(zhì)阻力，有利于水解的進行，反應速度隨溫度升高而加快，甘油酯濃度降低的速度隨溫度升高而增加；另一方面，脂肪酶變性失活程度隨溫度升高也迅速增加，在超過酶的適宜溫度范圍時，酶失活的速度比反應速度大得多，從而使水解反應速度急劇下降。從表4可以看出，當A處于55℃水平時，均有較高的水解率；當A處于65℃時，豬油水解率降低。因為溫度過高，抑制了脂肪酶的活性，導致水解率降低。
對因素B而言，油脂水解反應是可逆反應，緩沖液和豬油摩爾比是油脂水解重要因素。一方面，體系中摩爾比的增加可以推動可逆反應向右進行，從而加速水解反應的進行，提高豬油的水解率；另一方面，由于油脂水解反應在油水界面上，過量的緩沖液可以溶解稀釋生成的甘油酸，同樣可以提高水解率。超過一定比例就會達到一種平衡狀態(tài)。
對因素C而言，在酶催化水解中，酶用量直接影響反應速度和達到平衡所需的時間。如果脂肪酶的量太多，產(chǎn)物對酶的抑制作用會使水解效率降低。當脂肪酶用量太少時，酶的活力不足以使甘油酯水解到所要求的程度。但此時若適當提高脂肪酶的用量，水解效率則會顯著提高。當脂肪酶用量較大時，產(chǎn)物對酶的抑制作用等不利因素在反應中起主導作用，使水解產(chǎn)率降低。在工業(yè)生產(chǎn)中，須參考具體反應體系、操作條件及酶的價格等諸多因素，選擇適宜的脂肪酶用量，以獲取最好的經(jīng)濟效益。例如：酶用量較低時，可以采取加強攪拌、延長水解反應時間等方法加以彌補。
溶液中的pH值會影響脂肪酶的活性，不同脂酶最適pH不同，且脂酶單獨存在與參與反應時所表現(xiàn)出的最適pH值不甚相同。因為反應中pH值的影響是同其他的一些因素如底物的性質(zhì)、濃度和緩沖液種類等的影響相聯(lián)系的。相對而言，pH值在5.0～7.5之間變化時，對多數(shù)脂解反應影響不大。
由表4可以看出，影響豬油水解的因素，主次順序為：A>C>D>B。由圖1和表4可知，各因素水平的最佳組合為A2+C2+D3+B1。
3 結(jié)論
對于脂肪酶催化豬油的水解反應，其最佳反應溫度為55℃，pH值為6，適宜的水/豬油的摩爾比為60∶1, 脂肪酶的最佳用量為4%，水解7h，該條件下水解率可達84.21%。在工業(yè)生產(chǎn)中，需參考具體反應體系、操作條件與酶的價格等諸多因素，選擇適宜的脂肪酶用量，以獲取最好的經(jīng)濟效益。
（翁曉輝、王敏、杜紅方 廣東省飼料添加劑生物工程技術(shù)研究開發(fā)中心）
