李雪瑞 中國農業(yè)科學院
眾所周知，豬鏈球菌是畜牧養(yǎng)殖過程中極易遇到的、由多種鏈球菌引起的豬多種疾病的總稱，引起該病的細菌品種極多，在自然界中分布廣泛，極易呈地方性爆發(fā)。本文著重闡述外源營養(yǎng)依賴型豬鏈球菌的防疫機理，供各位獸醫(yī)同行參考。
對該菌的生長試驗表明，在沒有外源 D-丙氨酸的條件下，基因滅活菌株不能正常生長，在添加有外源 D-丙氨酸的條件下，變異菌可正常生長，但其生長速度（繁殖一代所需的時間）只有豬鏈球菌 2 型正常菌群的 1/3 左右。說明本研究通過滅活豬鏈球菌 2 型 98HAH33 基因組上負責合成D-丙氨酸的 D-丙氨酸消旋酶，獲得了必須依賴外源 D-丙氨酸才能生存的豬鏈球菌外源營養(yǎng)依賴型豬鏈球菌 2 型變異菌株。
在細菌體內，D-丙氨酸主要用于細菌細胞壁的合成，現有的研究表明，不同的細菌，其編碼D-丙氨酸合成的酶不盡相同。細菌可能含有一或者兩種丙氨酸消旋酶。如果細菌含有兩種丙氨酸消旋酶基因，其中的一種屬于組成型表達，其產物屬于合成代謝，另一種屬于誘導型表達，其產物用于分解代謝。它們表達的 D-丙氨酸對于細菌細胞壁的合成是必需的。目前，一些細菌基因滅活試驗已經證實，在缺乏外源 D-丙氨酸的條件下，丙氨酸消旋酶對相關細菌的生長是必須的。在一些細菌，例如單核細胞增生利斯特菌，細菌還可以通過 D-氨基酸轉氨酶來生成 D-丙氨酸。其它一些細菌，例如枯草桿菌，盡管也存在 D-氨基酸轉氨酶，但 D-丙氨酸消旋酶對于細菌的生存也是必要的。本次研究也表明，D-丙氨酸消旋酶對豬鏈球菌 2 型菌株的生長是必須的。
研究發(fā)現，用基因敲除的方法滅活基因組上的特定基因時，由于該技術尚未完全成熟，其成功與否取決于諸多因素。本研究也發(fā)現，當敲除臂的長度在 400 至 500 個堿基時，會造成基因滅活的失敗，而敲除臂的長度在 200 至 300 個堿基時，基因敲除的效果最好，該研究結果與 Thompson等人在李斯特菌中的研究結果一致。
目前，在一些研究中，通過對小鼠腹腔接種豬鏈球菌，進而觀察其發(fā)病和死亡狀況來確定細菌致病力的強弱。本研究通過對昆明小鼠腹腔接種不同劑量的豬鏈球菌正常菌株以及豬鏈球菌基因滅活菌株后發(fā)現，在 3.4×105劑量的強毒攻擊下，用強毒株豬鏈球菌攻擊的對照組小鼠有 7 只死亡，而用同等劑量的豬鏈球菌基因滅活菌株腹腔接種昆明小鼠后，小鼠沒有表現出明顯的臨床癥狀。在用豬鏈球菌營養(yǎng)缺陷菌株腹腔接種昆明小鼠后，也沒有小鼠表現出明顯的臨床癥狀，說明該菌的致病力減弱。本研究中的豬鏈球菌基因滅活菌株的致病力也減弱，其主要原因可能在于在小鼠體內，只有極其有限的 D-丙氨酸的存在，由此決定了豬鏈球菌基因滅活菌株在小鼠體內只能得到有限的生長，從而不能對小鼠造成感染。因此，我們推斷，用該基因滅活菌株免疫小豬，應該是有安全保障的。最終，我們篩選到一株豬鏈球菌營養(yǎng)缺陷菌株作為試制疫苗所用菌株，而隨后的實用免疫劑量測定結果、安全性試驗以及免疫效力試驗，均證實了用該菌株研制疫苗的可行性。
有關豬鏈球菌活疫苗的研究，由于受到多種因素的影響，結果也不一致。Holt 等用無毒菌株制作活疫苗，免疫豬后，免疫豬在受到強毒攻擊時得到保護，但在扁桃體或關節(jié)里已經定居的豬鏈球菌 2 型菌株沒有得到清除。Kebede 等用豬鏈球菌 2 型溫度敏感缺失菌株作為疫苗免疫小鼠時，小鼠可以抵御不同型豬鏈球菌強毒株的攻擊，但 Foster 等的結果與此不同，他們用一株豬鏈球菌 1/2 型突變株制作疫苗免疫動物，結果受免動物在受到同源菌株的攻擊時得到保護，但對對豬鏈球菌 2 型強毒株的攻擊只起到部分保護作用。 2007 年，Fittipaldi 等利用一株無毒、芳香族氨基酸營養(yǎng)缺陷型無莢膜菌株 BD101 作為活疫苗所做的研究顯示，接種該疫苗后，盡管接種動物出現輕微的副反應，但不影響接種動物的生長。免疫動物產生良好的針對豬鏈球菌 2 型的抗體反應， 用 S735 強毒攻擊后，免疫動物 100%存活。而未免疫動物 57%死亡。但在 Kock 等人2009所做的研究中，在對小豬免疫血清渾濁因子基因缺陷菌株 S. suis serotype 2 strain 10Deltaofs2/12后 3 周后，分別用豬鏈球菌 2 型和豬鏈球菌 9 型歐洲流行毒株攻擊，盡管產生了體液免疫反應，但沒有觀察到明顯的免疫效果。而在本研究中，免疫動物均產生了良好的體液免疫反應，同時也觀察到比較滿意的免疫效果。這可能與使用的毒株、佐劑等因素有關。據我們在多種細菌和病毒疫苗研制過程中得到的經驗，就是疫苗必須含有足夠的抗原成分，而合適的疫苗佐劑，能夠有效而大幅度提高疫苗的免疫效果。本研究經過比較多種疫苗佐劑的使用效果后，最終確定使用 305 納米佐劑。由于 305 納米佐劑具有控釋、緩釋作用，使得基因缺陷株鏈球菌能夠緩慢地釋放到機體中，持續(xù)而有效地刺激機體產生免疫反應，提高了疫苗的免疫效力。在后續(xù)的研究中，我們將測定該疫苗能否對同型其它菌株以及其它致病型的鏈球菌攻擊產生有效的保護性免疫
