高蕾 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
1.電鏡觀察
通過電鏡技術(shù)，觀察 SIV 的病毒粒子，呈橢圓形，棒狀和圓形，直徑約為 80 － 120 nm。雖然電鏡技術(shù)直接、客觀，但是對(duì)病毒滴度不僅要求高，設(shè)備昂貴，而且需要熟練的技術(shù)操作人員，故臨床檢測(cè)價(jià)值較低。
2.病原分離和鑒定
目前實(shí)驗(yàn)室中多采用細(xì)胞培養(yǎng)來分離病毒，但流感病毒對(duì)雞胚接種較敏感，故經(jīng)常用雞胚來分離培養(yǎng)流感病毒。初次采集的標(biāo)本（鼻腔洗液、鼻咽拭子等），一般采用雞胚羊膜腔接種法或羊膜腔和尿囊腔同時(shí)接種，以提高接種的陽性率。流感病毒的傳代培養(yǎng)用雞胚尿囊腔接種法 。王連想等在 2003 年報(bào)道分離了豬流感病毒廣東株并鑒定其為 H1N1 亞型毒株; 許傳田等在 2004 年報(bào)道從山東各地疑似流感發(fā)病豬分離并鑒定到 A 型流感病毒 H9N2 亞型; 李海燕等報(bào)道通過病毒分離和鑒定首次發(fā)現(xiàn)我國豬群已出現(xiàn) H5N1 亞型流感病毒。
3.血清學(xué)診斷
血清學(xué)技術(shù)是鑒定常規(guī)亞型最實(shí)用的診斷方法，主要包括紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)( hemagglutination，HA)和血凝抑制試驗(yàn)( hemagglutination inhibition，HI)，神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)( neuraminidase inhibition，NI)，瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)( agargel immunodiffusion，AGID) ，中和試驗(yàn) ( serum neutralizationtest ， SN) ，免疫過氧化酶單層細(xì)胞試驗(yàn)( immunoperoxidase monolayer assay， IPMA)，免疫熒光法( immunofluorescence assay，IFA) ，免疫組織化學(xué)( immunohistochemistry，IHC)以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)( enzymelinkedimmunosorbent assay，ELISA) 。
3.1紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)( HA)
SIV 顆粒表面的 HA 蛋白具有凝集某種(些)動(dòng)物紅細(xì)胞的能力，稱為病毒的血凝，利用這種特性設(shè)計(jì)的試驗(yàn)稱血球凝集(HA)試驗(yàn)，以此來推測(cè)被檢材料中有無病毒存在，是非特異性的，但病毒的凝集紅細(xì)胞的能力可被相應(yīng)的特異性抗體所抑制，即血球凝集抑制(HI)試驗(yàn)，具有特異性。DucaM 等在1942 年建立了 HA-HI 試驗(yàn)，由于血凝試驗(yàn)方便、快捷、易于操作，可用已知血清來鑒定未知病毒，也可用已知病毒來檢查被檢血清中的相應(yīng)抗體和滴定抗體的含量。血凝抑制試驗(yàn)( HI)：血凝抑制試驗(yàn)敏感、特異，常用于甲型流感病毒亞型的鑒定和抗原變異的分析，需要注意的是，許多動(dòng)物血清中有非特異性血凝因子，可能產(chǎn)生假陽性，故通常用高碘酸鈉法或受體破壞酶( receptor destroying enzyme，RDE)去除非特異性抑制因子。
3.2神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)( NI)：
NI 主要用于鑒定流感病毒的表面抗原 NA 的亞型。1983年，Van Deuson 等建立了微量 NI 試驗(yàn)方法，既降低了抗原用量，又可對(duì)多種分離物同時(shí)進(jìn)行抗原分類，此法一直被世界衛(wèi)生組織推薦用于 NA 亞型的分類。美國國立獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)所已將該方法列為流感病毒分離物定型及篩選畜禽血清亞型 NA 抗體的常規(guī)方法。
3.3瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)( AGID)：
AGID 是在瓊脂凝膠中進(jìn)行的免疫沉淀反應(yīng)，其主要優(yōu)點(diǎn)是快捷、簡(jiǎn)便，而且比較保守，基本不發(fā)生變異。由于 SIV 的不同亞型都具有型特異性抗原( NP 蛋白) ，故可用一種流感抗原或抗體檢測(cè)所有抗體或抗原。用標(biāo)準(zhǔn)抗原監(jiān)測(cè)抗體時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)抗原可以是全病毒，也可以是基因產(chǎn)物。AGID 所用的抗原和抗體的一種必須純化，否則，易產(chǎn)生假陽性。另外，AGID 的敏感性較差，經(jīng)改進(jìn)的 AGID 免疫雙擴(kuò)散試驗(yàn)，不僅提高了敏感性，而且快速省時(shí)。SIV 的檢測(cè)手段中，AGID 操作比較簡(jiǎn)單，結(jié)果容易判定，但其敏感性偏低。故將重組的 NP 蛋白進(jìn)行純化，將其作為檢測(cè)抗原建立間接 ELISA 診斷試劑盒可提高其敏感性。國內(nèi)已建立了 AGP 診斷技術(shù)及其診斷試劑盒。
3.4中和試驗(yàn)( SN)：
中和試驗(yàn)作為經(jīng)典診斷方法在病毒鑒定中非常重要，很多新的檢測(cè)方法都要以此為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。用 SN 來鑒定或滴定 SIV 時(shí)，一般常選用對(duì)病毒敏感的組織培養(yǎng)細(xì)胞或雞胚。SN 是較特異、敏感的血清學(xué)方法，但只有抗體與病毒上的表面抗原相對(duì)應(yīng)，尤其 是與吸附到宿主細(xì)胞上的病毒表面抗原相對(duì)應(yīng)時(shí)才能取得確切的結(jié)果。中和試驗(yàn)在研究應(yīng)用中較廣泛，但其操作繁瑣，費(fèi)時(shí)間（一周左右），耗材料，故在實(shí)際臨床診斷中不常使用。
3.5免疫過氧化酶單層細(xì)胞試驗(yàn)( IPMA)：
該技術(shù)用于檢測(cè)豬血清中的 SIV 抗體。其特點(diǎn)是 特異性強(qiáng)，可檢測(cè)出感染后 3 d 的抗體效價(jià)。本方法不需對(duì)待檢血清血清進(jìn)行處理，可同時(shí)檢測(cè)兩種亞型，更便于對(duì)豬群進(jìn)行流感抗體的監(jiān)測(cè)。
3.6免疫熒光法( IFA)：
免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。 IFA 的最大優(yōu)點(diǎn)是穩(wěn)定、敏感性和特異性高，值得推廣應(yīng)用。早在 1961 年就開始將 IFA 用于人類流感的快速診斷，此后又有很多研究人員用該方法檢測(cè)流感病毒。用于豬流感診斷的方法，有直接熒光抗體法和間接熒光抗體法，但多用間接熒光抗體法。Onno 等用基于 NP 單克隆抗體的間接免疫熒光技術(shù)對(duì)試驗(yàn)感染豬鼻上皮細(xì)胞中的抗原進(jìn)行檢測(cè)，特異性熒光出現(xiàn)在感染細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)果表明該法與雞胚分離病毒一樣敏感，并且能在數(shù)小時(shí)內(nèi)快速得到診斷結(jié)果。
3.7酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)( ELISA) ：
ELISA 是目前應(yīng)用最廣泛的病毒抗原及抗體的檢測(cè)技術(shù)，已建立了多種方法，如間接法、雙抗體夾心法、捕獲法和生物素－ 親和素法等。早在 1974 年就用于流感病毒的檢測(cè)，因其敏感性高，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便，肉眼可觀察，便于大規(guī)模檢測(cè)，適合于現(xiàn)場(chǎng)和基層使用，被認(rèn)為是近代血清學(xué)上革命性的新成果。近年來，在傳統(tǒng) ELISA 方法的基礎(chǔ)上，研究者們對(duì)其做了進(jìn)一步改進(jìn)。Swenson 等應(yīng)用膜酶免疫試驗(yàn)和微孔膜免疫試驗(yàn)對(duì)流感病毒進(jìn)行了檢測(cè);Voeten 等應(yīng)用重組流感病毒核蛋白作為抗原包被 ELISA 板，對(duì)流感患者進(jìn)行特異性 IgA 及 IgG 抗體檢測(cè)，在感染后第 6 天，便可檢測(cè)出特異性的 IgA，故其可以作為流感早期的血清學(xué)診斷方法之一?？何娜A等建立了 PCR-ELISA 方法快速檢測(cè)高致病性禽流感病毒。
3.8免疫組織化學(xué)( IHC) ：
免疫熒光技術(shù)和免疫組織化學(xué)試驗(yàn)的敏感性相近，但免疫組織化學(xué)試驗(yàn)?zāi)苡糜谑瑱z時(shí)固定良好，并且送檢過程中沒喪失組織完整性的病料。SIV 感染后 3 d，肺部細(xì)胞感染的數(shù)量達(dá)到高峰，到第 5 天時(shí)許多病毒都已經(jīng)排出。Kwonil 等也應(yīng)用免疫組織化學(xué)試驗(yàn)對(duì) H1N2 亞型豬流感進(jìn)行了確診，證實(shí)韓國 2005 年首次報(bào)道發(fā)生的 H1N2 亞型豬流感。
