廉傳江 吉林大學(xué)
1.直接克隆測序方法
小 RNA 分子的直接克隆測序仍然是目前鑒定 miRNA 的主要方法之一。miRNA 的克隆是利用 T4 RNA 連接酶在小 RNA 分子的兩端連接上接頭序列，隨后反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 文庫克隆到質(zhì)粒載體并測序。目前，許多研究小組已經(jīng)利用這種方法成功地從各個(gè)物種中克隆鑒定了大量的 miRNA。直接克隆方法最大的優(yōu)點(diǎn)是精確確認(rèn) miRNA，能夠區(qū)分開只差一個(gè)堿基的家族分子。
然而，直接克隆也存在著明顯的局限性：一方面，由于文庫的構(gòu)建是一個(gè)長期的過程，且每個(gè)文庫需要經(jīng)過大量的測序反應(yīng)才能獲得足夠的數(shù)據(jù)，耗時(shí)且低效；另一方面，由于部分 miRNA 的組織特異性以及低豐度表達(dá)，加之其它內(nèi)源性非編碼 RNA和 mRNA 的降解產(chǎn)物的干擾，該方法很難鑒定那些組織特異性低表達(dá)的或堿基構(gòu)成特殊、存在轉(zhuǎn)錄后修飾的 miRNA。
但是，近年來高通量測序技術(shù)（如 454，Solid 和 Solexa 等測序平臺）的突破極大的完善了該方法，其可以一次性產(chǎn)出百萬級的高質(zhì)量小分子 RNA 序列，能夠從全基因組水平大范圍地發(fā)掘已知和未知、保守和非保守的 miRNA，彌補(bǔ)了過去難于鑒定低豐度或組織特異性表達(dá) miRNA缺點(diǎn)；同時(shí)可以構(gòu)建樣品間的小分子 RNA 差異表達(dá)譜，為小分子 RNA 的鑒定及功能研究提供了強(qiáng)有力的工具，從而在動植物 miRNA 及其他各種內(nèi)源小分子RNA 的鑒定中得到越來越廣泛的應(yīng)用。
2 生物信息學(xué)預(yù)測
隨著各生物全基因組測序的完成，生物信息學(xué)方法逐漸發(fā)展成為鑒定miRNA 的有力方法，這種方法可以彌補(bǔ)直接克隆法的一些不足，大大提高鑒定miRNA 的效率。生物信息學(xué)方法主要依據(jù)在不同的物種中，成熟的 miRNA 具有高度的序列同源性、前體的莖環(huán)結(jié)構(gòu)具有較高的保守性、其結(jié)構(gòu)和序列的熱力學(xué)穩(wěn)定性與已知 miRNA 具有相似性、其在基因組中往往成簇排列、以及其與靶基因序列的堿基互補(bǔ)配對模式具有保守性的這些特征，在基因組數(shù)據(jù)庫中搜索新的miRNA 基因，它依賴于物種的基因組或轉(zhuǎn)錄組信息。
目前已有很多種針對不同物種設(shè)計(jì)的 miRNA 預(yù)測軟件，算法各不相同，但都以 miRNA 的共有特征為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行預(yù)測。MiRscan 是第一個(gè)預(yù)測軟件，它能特異識別 2 個(gè)物種間的同源序列。Lim 等于 2003 年利用它在 C.elegans 和 C.briggsae 中尋找到同源的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，通過與已知 miRNA 序列比對后，成功的預(yù)測出了線蟲的 35 種新 miRNA。另一個(gè)預(yù)測軟件 snarloop 已在線蟲中預(yù)測出了 214 種 miRNA。RNAz 軟件通過結(jié)合熱力學(xué)穩(wěn)定性和二級結(jié)構(gòu)保守性來預(yù)測非編碼 RNA。MiRseeker 軟件則是根據(jù) miRNA 前體二級結(jié)構(gòu)的保守性、在相似的物種中成熟 miRNA 序列的保守性、在相距較遠(yuǎn)的物種間 miRNA 則具有一定的分歧的這 3 個(gè)特點(diǎn)設(shè)計(jì)完成的，利用該軟件已經(jīng)在人類和其他物種中預(yù)測出了 800 多種新 miRNA。
如在果蠅中Lai 等人利用該軟件預(yù)測出 48 個(gè) miRNA，其中 24 個(gè)已被實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。另外，也可以通過分析基因中潛在的靶序列倒推出 miRNA。Xie 等人比對了一些哺乳動物基因組 3′-UTR 保守序列中的共有序列，發(fā)現(xiàn)這些序列與一些已知的 miRNA 的5′種子序列（seed sequence）互補(bǔ)，并預(yù)測出了 129 種新的 miRNA。生物信息學(xué)預(yù)測的方法雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的 miRNA，但是由于其本質(zhì)是根據(jù)少量的已知 miRNA 或 pre-miRNA 總結(jié)規(guī)律，去發(fā)現(xiàn)大量的新 miRNA。
然而目前已知miRNA 的數(shù)量較少，從中總結(jié)的規(guī)律不足以代表整個(gè) miRNA 家族，因而使得生物信息學(xué)預(yù)測不可避免的會產(chǎn)生大量的假陽性數(shù)據(jù)。此外，該方法只能應(yīng)用于擁有背景數(shù)據(jù)庫的物種，沒有基因組或轉(zhuǎn)錄組信息的物種無法預(yù)測，也難于預(yù)測物種特異的 miRNA，所以目前多數(shù)實(shí)驗(yàn)室結(jié)合了高通量的實(shí)驗(yàn)手段和計(jì)算機(jī)方法來鑒定更為廣泛的 miRNA。
