徐國華 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
基因工程亞單位疫苗又稱重組亞單位疫苗或者生物合成亞單位疫苗。主要原理就是將目的抗原基因?qū)朐思?xì)胞或真核細(xì)胞，使其大量表達(dá)，然后再人工提取保護(hù)性膚鏈，與佐劑混合制成疫苗。豬鏈球菌2型目前尚無用于臨床的商品化基因工程疫苗。隨著對(duì)552毒力因子的研究深入，畜牧研究人員開始從毒力因子下手研究其免疫保護(hù)作用，從而來篩選合適的亞單位疫苗。目前研究報(bào)道的毒力因子有莢膜多糖、溶菌酶釋放蛋白、細(xì)胞外因子、溶血素、纖連蛋白結(jié)合蛋白、Sao蛋白等。
1莢膜多糖(Cps)
莢膜多糖存在于細(xì)菌的細(xì)胞壁，具有抗吞噬活性，在豬鏈球菌致病過程中發(fā)揮作用，與其他細(xì)菌莢膜一樣，552莢膜同樣表現(xiàn)出免疫原性，但是較弱，需要與其他毒力蛋白相結(jié)合才能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。 BaumscG等人使用552莢膜偶聯(lián)BSA免疫豬獲得高價(jià)血清，并對(duì)其殺菌活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
2溶菌酶釋放蛋白和細(xì)胞外因子EF
MRP存在于細(xì)胞表面，為細(xì)菌的胞壁蛋白，具有良好的免疫原性，理論上是良好的保護(hù)性抗原，可作為亞單位疫劑也影響亞單位苗的效價(jià)。另外，單獨(dú)以MRP或EF進(jìn)行免疫，其保護(hù)率也較高，但MRP免疫組的臨床癥狀同EF免疫組相比顯著減輕。另外，這種疫苗缺陷在于，由于亞單位苗的抗原成分單一，這對(duì)于天然缺乏這種毒力因子的552的感染起不到保護(hù)作用。研究表明，包含MRP和EF兩種毒力因子的，以油包水為佐劑的亞單位疫苗可以有效預(yù)防高致病力豬鏈球菌2型的感染。
李明等以552溶菌酶釋放蛋白(MRP)和胞外因子(EF)抗原性較強(qiáng)的基因序列，分別構(gòu)建表達(dá)載體pET32a一MRP、pET32a一EF，westem方法確定誘導(dǎo)表達(dá)的兩各蛋白都具有免疫原性后，串聯(lián)表達(dá)后用融合蛋白MRP一EF免疫新西蘭大白兔，以最小致死量552強(qiáng)毒株攻毒，存活率明顯高于單個(gè)表達(dá)產(chǎn)物，證實(shí)串聯(lián)表達(dá)的融合蛋白可以是重要的保護(hù)性抗原。
范紅結(jié)等于2004年克隆了 552HA9801株MRp基因的部分抗原性較強(qiáng)的片段，表達(dá)出大小為42kDa的重組蛋白，經(jīng)純化、混合弗氏佐劑和免疫Balb/C小鼠，最后以5倍的LDS。的552強(qiáng)毒攻擊，小鼠的存活率都較高，表明MRP具有較強(qiáng)的保護(hù)性抗原功能，也提示該片段部分為MRP重要的功能區(qū)。
5.3溶血素 (SLY)
豬鏈球菌2型溶血素(hemolysin)，也稱豬溶素(suilysin)，是由552產(chǎn)生的釋放至細(xì)胞外的具有細(xì)胞毒性作用的一種毒素。通過作用于紅細(xì)胞膜上的膽固醇而溶解紅細(xì)胞。1994年，JacobS從等對(duì)豬鏈球菌2型的溶血素進(jìn)行了提純，然后免疫Balb/C小鼠，結(jié)果顯示小鼠得到了完全的免疫保護(hù)，證明豬鏈球菌2型的溶血素具有免疫保護(hù)作用，研究還發(fā)現(xiàn)，各種血清型的豬鏈球菌均能產(chǎn)生相似的溶血素，提示SLY可能具有較好的免疫交叉保護(hù)作用。1996年，他們將SLY和豬鏈球菌2型的其他細(xì)胞外抗原 (extracellularantigens)對(duì)豬的免疫保護(hù)作用進(jìn)行了對(duì)比，證實(shí)豬溶血素的免疫保護(hù)作用要明顯優(yōu)于不含溶血素的其它細(xì)胞外抗原。2003年Luns等研究顯示，豬鏈球菌2型的SLY在刺激細(xì)胞因子的釋放和起始免疫過程中具有重要作用。2007年王華等擴(kuò)增了四川552株s比的653bp大小的主要片段，表達(dá)出43kDa大小的融合蛋白，并能跟552的抗血清發(fā)生反應(yīng)，小鼠實(shí)驗(yàn)表明，該蛋白的菌苗效應(yīng)為60%，相比較于全菌滅火苗的80%的菌苗效應(yīng)，其保護(hù)率已經(jīng)相當(dāng)可觀。2008年楊影158]擴(kuò)增出豬鏈球菌2型的sLY的全基因，表達(dá)的融合蛋白大小為57kDa，westemblot表明其具有良好的免疫反應(yīng)性。
sLY作為亞單位疫苗的對(duì)象具有很多的優(yōu)點(diǎn)，但是很多研究發(fā)現(xiàn)隊(duì)59]許多552分離株都不含該蛋白，因此使用范圍受到了極大的限制。苗的候選蛋白。EF僅能從培養(yǎng)物上清液中檢出，為細(xì)胞外蛋白。對(duì)這兩個(gè)蛋白的研究最多，也最深入。
Wisselink等報(bào)道，用親和層析法提取552的這兩種蛋白MRP和EF，再以不同的佐劑:油包水(awater-in一oilemulsion[w/o])和鋁膠(alumiiuxn場(chǎng)droxide一basedadjuvant[AH1)制備成亞單位疫苗，并測(cè)定其免疫效果。分別在3周齡和6周齡的仔豬各免疫1次。8周齡時(shí)靜脈注射同源或異源的552。結(jié)果表明，以MRP+EF/W/O進(jìn)行免疫的保護(hù)作用同以油包水為佐劑的全菌滅活疫苗相當(dāng)，能有效地保護(hù)552的感染。而以鋁膠為佐劑的疫苗作用則大大降低，與用安慰劑免疫的對(duì)照組無明顯差異。
5.4 552其他亞單位疫苗研究
LIY等人通過研究發(fā)現(xiàn)一種 110kDa蛋白，命名為sao蛋白。利用免疫電鏡技術(shù)證明該蛋白表達(dá)于細(xì)菌表面，利用 WestemBlot證明在檢測(cè)的33種血清型中有28種可以檢測(cè)到sao蛋白。有實(shí)驗(yàn)證明，sao蛋白對(duì)表達(dá)sao變異體的菌株同樣有保護(hù)性。
Yuanyi等人將純化后的sao蛋白與QullA混合免疫6周齡的cD一1雌鼠以及4周齡的仔豬，可使它們對(duì)552的攻擊產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)作用。因此對(duì)于異源的552感染具有有效的免疫保護(hù)作用，證明其可作為豬鏈球菌的候選疫苗。
zharig等鑒定了552的一個(gè)新的保護(hù)性抗原:烯醇化酶，實(shí)驗(yàn)表明烯醇化酶可產(chǎn)生足夠的抗體保護(hù)小鼠免受552的攻擊。 deeree份等將552的纖連蛋白FBPs伍broneetin一 bindingprotein)的基因加s轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行大量表達(dá)，將表達(dá)的產(chǎn)物提純后免疫兔子，首免后28d進(jìn)行二免，二免后第三周時(shí)將兔子處死，收集血清進(jìn)行檢測(cè)，可以檢測(cè)到FBPS抗體的存在，證明豬鏈球菌2型的纖連蛋白有很好的免疫原性，可用于基因工程亞單位疫苗的構(gòu)建。Wintethoff等發(fā)現(xiàn)并鑒定了兩種分子量分別為 47kDa和53切a的細(xì)菌表面熱應(yīng)激蛋白，這兩種蛋白與精氨酸脫氫酶系統(tǒng)高度同源，并與莢膜多糖相伴出現(xiàn)，可刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
Gottschalk通過以高致病力的552為基礎(chǔ)構(gòu)建了兩株無致病力的細(xì)菌突變株，通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)一種分子量為 44kDa的胞壁蛋白存在于親株中，而在突變菌株中則不存在，該蛋白具有很好的免疫原性，是552的毒力因子之一。
