余騰 華中師范大學(xué)
1.PCR模板的制備
在TSA上生長的單菌落，直接用接種環(huán)挑取，重懸于盛有50μL無菌單蒸水中的EP管中，煮沸10min，然后速置于冰上冷卻10min，隨后12000r/m離心smin，上清即為PCR模板;對于臨床采集的鼻拭子樣品，先將鼻拭子放入TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6一sh，隨后12000r/m離心10min，取出棉拭子，棄上清，加入50微升無菌單蒸水重懸，在微波爐中煮沸10min后，速置于冰上冷卻10min，然后12000r/m離心5min，上清液即為PCR模板。
2.巢式PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化
巢式PcR的反應(yīng)體系都設(shè)定為25微升， 10 x Taq Buffer為2.5微升，第一輪PCR模板量為6微升，第二輪PCR模板量為2微升。將Taq聚合酶，引物和dNTPs分別配制不同濃度，加入到PcR反應(yīng)體系中，最后加入滅菌的單蒸水至總體積25微升。第一輪，第二輪PCR反應(yīng)的每個反應(yīng)體系中Taq聚合酶的量分別設(shè)定為0.5u，1.0u，1.5u，2.0u，2.5u，3.0u等六個梯度;引物的終濃度分別設(shè)定為0.16微摩爾/升，0.24微摩爾/升，0.32微摩爾/升，0.4微摩爾/升，0.48微摩爾/升等五個濃度梯度;dNTPs的終濃度分別設(shè)定為0.02mmol/L， 0.03mmol/L， 0.04mmol/L， 0.05mmol/L， 0.06mmol/L等五個濃度梯度。
3.巢式PCR反應(yīng)程序的優(yōu)化
巢式PCR的第一輪，第二輪PCR反應(yīng)的預(yù)變性溫度和時間都設(shè)定為94OC，smin，延伸溫度都設(shè)定為72℃，循環(huán)數(shù)為30，最后一輪循環(huán)后，72攝氏度延伸5min，隨后降至40攝氏度保存。第一輪PCR變性溫度和時間分別設(shè)定為94OC，305;退火時間為305;第二輪PCR變性溫度和時間分別設(shè)定為94OC，355，退火時間為355。對第一輪，第二輪PCR反應(yīng)分別設(shè)置不同的退火溫度和延伸時間進行PCR反應(yīng)。
4.巢式PCR檢測方法的敏感性
將 T+PmHN一13在TSA平皿上進行劃線培養(yǎng)，挑取單菌落放入TSB培養(yǎng)基中，在37℃條件下培養(yǎng)sh，隨后將其進行10一‘、10一2、10一“…10一8倍比稀釋，最后三個稀釋度的菌液各取100仁L進行平板記數(shù)，每個稀釋度有兩個重復(fù)，同時將各個稀釋度的菌液各取100卜L按照3.2.1.1中的方法制備PCR模板，每個稀釋度做分別制備兩個重復(fù)。將制備好的模板進行巢式PCR，確定其方法的敏感性。
5.巢式PCR檢測方法的特異性
分別提取大腸桿菌、Bb、T一Pm、豬霍亂沙門氏菌、豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌和胸膜肺炎放線桿菌等菌的基因組，分別運用本方法進行巢式PCR，驗證其方法的特異性。
6.巢式PCR檢測方法的可重復(fù)性
將巢式PCR反應(yīng)體系中的引物，1價 TaqBuffer，dNTPs等試劑在-20℃條件下經(jīng)過幾次反復(fù)凍融，隨后對T+Pm的基因組提取物進行巢式PCR擴增，確定巢式PCR檢測方法的可重復(fù)性。
7.巢式PCR方法與其它方法的符合率試驗
用本研究中優(yōu)化的方法與ehangsun等畜牧研究人員建立的巢式PeR方法對臨床采集的一批鼻拭子樣品進行檢測，進行兩種檢測方法的符合率試驗，根據(jù)檢測的結(jié)果，驗證兩種巢式PCR方法的符合率。
