吳志強 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
綜合前言所述，印跡基因的正常表達，對于胚胎的正常生長和發(fā)育十分重要。由于DNA的甲基化是印跡形成和維持的最可能機制，印跡基因差異性甲基化區(qū)的DNA甲基化水平異常可能會導(dǎo)致印跡基因不表達或異常表達，從而影響胚胎的正常生長發(fā)育。
正因為印跡基因的正常表達如此重要，國內(nèi)外許多畜牧研究小組對印跡基因甲基化水平經(jīng)行了分析。ogawa等分析了8個印跡基因在克隆小鼠胚胎及胎盤的表達，結(jié)果顯示IGFZ和Hj夕基因是表達異常的，并指出IGFZ的異常表達可能是導(dǎo)致胚胎和胎盤過度生長的原因，同時他們還利用亞硫酸氫鹽測序法檢測了這兩個基因的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)其甲基化水平是異常的。同年，在檢測IGFZ和Hj夕基因在克隆小鼠胚胎和胎盤中表達時，發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果(IGFZ和HI夕基因是表達異常)，并指出HI夕和階滬rn基因的DMR甲基化狀態(tài)是異常。
Young等分析了克隆羊印跡基因的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)12頭克隆羊中IGFZR基因的差異性甲基化區(qū)呈低水平的甲基化，HI夕基因的差異性甲基化區(qū)域也存在不同程度的異常。李長雷等發(fā)現(xiàn)克隆山羊胎兒胎盤組織中Hj，基因第5個cpG島的甲基化水平顯著高于對照組，萬Z夕基因相對表達量顯著低于對照組;肺臟組織甲基化水平顯著低于對照組，相對表達量顯著高于對照組。
Lucifero等對8頭克隆牛胎兒進行了甲基化分析，發(fā)現(xiàn)印跡基因snrPn在7頭克隆牛胎兒中呈低甲基化狀態(tài)。隨后對牛人工受精胚、體外受精胚及體細胞克隆胚中SnrPn基因的表達及甲基化水平進行了研究。結(jié)果顯示，在體細胞克隆牛胚胎中，SnrPn基因呈雙等位基因表達，并且其差異性甲基化區(qū)存在甲基化的嚴(yán)重缺失，而在人工受精胚胎和體外受精牛胚胎中則無此現(xiàn)象。Long等分析了克隆牛心腦組織的差異性甲基化區(qū)及非差異性甲基化區(qū)的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)克隆?；虿町愋约谆瘏^(qū)的甲基化變化程度要較正常牛大，而非差異性甲基化區(qū)變化水平則無明顯變化。Liu等檢測了自發(fā)流產(chǎn)的克隆牛胎兒中4個印跡基因DMR的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)4個印跡基因均有不同程度的甲基化紊亂。chen等分析克隆牛不同組織中印跡基因甲基化狀態(tài)時發(fā)現(xiàn)體細胞克隆牛肺臟中HIg基因甲基化程度顯著低于正常對照牛，Xist基因甲基化程度與正常對照牛無顯著差異。
上述研究結(jié)果顯示:無論克隆小鼠、羊和牛都有被檢測到存在印跡基因的異常甲基化。而目前有關(guān)印跡基因甲基化狀態(tài)也主要集中在這3個物種上，在豬上的研究較少，也較晚。Park等曾報道豬卵母細胞、精子、體外受精胚、孤雌胚及附植前胚胎IGFZ/111夕基因印跡控制區(qū)DMR3的甲基化狀態(tài)，診釋了該區(qū)域印跡形成的過程。wei等檢測了印跡基因在克隆豬胎盤及附植前胚胎中的表達及甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示IGFZ和Hj夕基因在新生死亡克隆豬胎盤中的甲基化水平比存活克隆豬胎盤和自然繁殖豬胎盤高。而印跡基因在在克隆豬不同組織中的甲基化狀態(tài)未見報道。
本試驗以同期正常豬不同組織為對照，利用亞硫酸氫鹽測序法檢測了IGFZ/Hj夕基因和IGFZR基因DMRs在新生死亡克隆豬心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟中的DNA甲基化狀態(tài)。結(jié)果顯示，IGFZ/Hj夕基因DMRZ在新生克隆豬肺臟組織中處于超甲基化狀態(tài)，極顯著高于正常豬(P<0.01);IGFZR基因DMRZ在新生克隆豬肝臟中處于超甲基化狀態(tài)，顯著高于正常豬(P<0.05)，而在肺臟中處于去甲基化狀態(tài)，極顯著低于對照組(P<0.01)。結(jié)果說明IGHj夕基因在克隆豬肺臟組織中存在甲基化狀態(tài)異常，IGFZR基因在克隆豬肺臟和肝臟中存在甲基化狀態(tài)的異常。這與前面所述的其它克隆動物(克隆鼠、羊和牛上的研究結(jié)果類似，應(yīng)該是克隆豬也有存在印跡異常的現(xiàn)象。然而這個結(jié)果與魏延昌等提到的Hj夕基因甲基化水平在存活克隆豬、死亡克隆豬和自然繁殖豬的甲基化水平差異不顯著有一定的沖突。這可能與我們所取用的組織樣品有關(guān)，我們是以克隆豬內(nèi)臟組織為材料，也可能與克隆豬個體差異有關(guān)。這還需要更深入的研究。
魏延昌等還分析了克隆豬囊胚內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層細胞的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)IGFZ基因和Hl夕基因在內(nèi)細胞團中的甲基化水平較正常，而在滋養(yǎng)層中的甲基化水平很低。并指出滋養(yǎng)層中這樣異常甲基化可能與胎盤的發(fā)育異常有關(guān)，還推測印跡異常的細胞可能優(yōu)先參與滋養(yǎng)層的形成，而印跡正常的細胞則優(yōu)先參于內(nèi)細胞團的行成。除了胎盤，克隆動物胎內(nèi)器官一肺，也往往被檢測到DNA甲基化異常。李長雷等研究新生死亡克隆山羊不同組織甲基化狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)克隆山羊胎兒胎盤組織和肺臟組織中Hj夕基因第5個CpG島的甲基化水平顯著高于正常對照羊，導(dǎo)致Hj夕基因表達量顯著提高。Chen等發(fā)現(xiàn)新生死亡克隆牛肺臟組織，基因甲基化程度顯著低于正常對照牛，而基因甲基化程度與正常對照牛無顯著差異。因此，我們猜想在克隆動物內(nèi)臟組織的分化、形成過程中會不會存在優(yōu)先分化的現(xiàn)象。既內(nèi)細胞團中印記異常的細胞優(yōu)先參某些器官的形成(如肺臟)，而印跡正常的細胞則優(yōu)先參與另一些器官的形成，這也需要去進一步的研究和發(fā)現(xiàn)。
