宋梟 西北農(nóng)林科技大學(xué)
獸醫(yī)在豬瘟的臨床診斷中主要根據(jù)測試體溫、臨床發(fā)病情況、特點(diǎn)、傳播方式、易感動物、死后剖檢觀察的病理變化，可做初步診斷。
1. 血清學(xué)診斷
(1)病毒分離（VI）
病毒可以從組織勻漿、血清、血漿、肝素或 EDTA 收集的全血當(dāng)中分離出來。扁桃體、回盲淋巴結(jié)、脾臟、腎臟、喉頭淋巴結(jié)等含病毒組織。病毒也可用豬腎細(xì)胞 PK-15 或 SK6 分離。所用細(xì)胞、介質(zhì)和試劑必須保證沒有瘟病毒或其抗體。
(2)免疫熒光抗體試驗(yàn)( FAT)
免疫熒光抗體試驗(yàn)在冰凍組織上的病毒抗原檢測是一種靈明而又特異的診斷方法，已被世界多個國家和地區(qū)作為豬瘟的法定診斷方法。扁桃體作為病毒的復(fù)制起點(diǎn)，是做 FAT 最合適的組織樣品。對于亞急性或慢性病例，首選回腸遠(yuǎn)端作為組織樣品。
(3)間接血凝試驗(yàn)（IHA）
A 正向間接血凝試驗(yàn) 是利用 CSFV 能夠致敏紅細(xì)胞，從而將待檢血清經(jīng)行 2 倍的梯度稀釋后使之與抗原產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)，出現(xiàn)紅細(xì)胞的凝集反應(yīng)，然后根據(jù)紅細(xì)胞的凝集多少來判斷結(jié)果。此法能夠測出豬體內(nèi)豬瘟抗體的效價(jià)，有簡便易操作的特點(diǎn)，廣泛用于規(guī)模化豬場的免疫抗體監(jiān)測。缺點(diǎn)是不能夠區(qū)分抗體效價(jià)是由于疫苗免疫還是野毒感染所引起。
B 反向間接血凝試驗(yàn) 通過提取豬瘟免疫血清中的 I g G 來致敏綿羊紅細(xì)胞，用于檢測 CSFV 抗原。該方法能夠檢測如脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體等病原較集中存在的組織中的 CSFV 抗原。存在的問題是用于處理組織病料的方法有差異，所以易對組織中的血細(xì)胞造成干擾，使得非特異性凝集出現(xiàn)而難以判定結(jié)果，因而現(xiàn)在已較少應(yīng)用。
(4)中和試驗(yàn)
A 兔體中和試驗(yàn) 是將 CSFV 與待檢血清中和后接種到家兔體內(nèi)，然后觀察家兔的體溫變化曲線。以血清稀釋度在 1︰32 為標(biāo)準(zhǔn)值，當(dāng)待檢血樣的血清稀釋度大于該標(biāo)準(zhǔn)值時，表明被檢血樣血清含有足夠的 CSFV 抗體水平；當(dāng)待檢血清稀釋度小于標(biāo)準(zhǔn)值時，說明被檢血樣的 CSFV 抗體水平較低，應(yīng)當(dāng)立即對豬群進(jìn)行緊急免疫接種。但是 CSFV會和與之同源性較高的BVDV在血清學(xué)上有交叉反應(yīng)。所以血清檢測時要分別對CSFV、BVDV 做中和試驗(yàn)，如果 CSFV 抗體效價(jià)高，則可能是 CSFV。要確切區(qū)分 CSFV 和BVDV，需要用到單克隆抗體技術(shù)和核酸探針技術(shù)。B 熒光抗體病毒中和試驗(yàn)（FAVN）是國際貿(mào)易指定方法。通過 PK-15細(xì)胞飛片培養(yǎng)。把待檢血清置于 56 ℃條件下滅活 30 min 后做一定稀釋，在與等體積的200 TCID50/0.1 ml 的病毒液作用約 2 h 后接入片上吸附 1 h 后加入維持液孵育 48 h 以上。
對照組的設(shè)立采用直接免疫熒光的方法進(jìn)行熒光觀察?？梢园l(fā)現(xiàn)對照組含有翠綠色光斑，而試驗(yàn)組無光斑。該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便，特異性強(qiáng)。缺點(diǎn)是僅能對病毒定性，不能對其定量。
C 過氧化物酶聯(lián)中和試驗(yàn)（NPLA） 將稀釋后的待檢血清與 200 TCID50/50 μL 的病毒液混合培養(yǎng)上一段時間后接入細(xì)胞生長。在細(xì)胞長到單層后固定后加入豬高免抗CSFV 血清，隨后通過滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的豬抗 Ig G(Ig G- HRP)和底物作用后顯色，最后以顯示的顏色來判定結(jié)果。NPLA 的優(yōu)點(diǎn)是其結(jié)果可以通過肉眼進(jìn)行判定，且無需飛片。
(5)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）
該方法是用已知 CSFV 抗原包被板，將待檢血樣血清稀釋后加入包被板板孔中，在一定條件下反應(yīng)后加入 HRP 標(biāo)記的葡萄球菌蛋白 A（PPA）或其他可與抗體結(jié)合的物質(zhì)，然后作用一定時間之后加入底物并顯色，在短時間內(nèi)用酶標(biāo)儀讀取每個板孔的 OD 值，最后根據(jù)特定的判定方式來判定每個結(jié)果。ELISA 方法操作相對簡單，短時間內(nèi)可得結(jié)果。但是據(jù)報(bào)道目前的 ELISA 方法的敏感性比不上細(xì)胞上的病毒分離。此外，仔豬待檢血清樣品的敏感性明顯高于成年豬或亞臨床感染豬。為了補(bǔ)償診斷敏感性的缺陷，豬群內(nèi)所有表現(xiàn)發(fā)熱癥狀的個體逐個進(jìn)行檢測，并且不排除出現(xiàn)假陽性的可能。
2 分子生物學(xué)方法
(1) RT-PCR 技術(shù)
該技術(shù)是選定一個相對保守的基因區(qū)域來合成特異性引物，同時使用下游特異性引物將病毒的 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 c DNA，最好用引物對其進(jìn)行擴(kuò)增，從而獲得目標(biāo)片段。
(2)熒光定量 PCR(FQ-PCR)
熒光定量PCR是由美國Perkin Elmer公司于1995年研制出來的一種核酸定量技術(shù)。根據(jù)所用熒光化學(xué)的不同可分為 2 種方法：熒光探針法和熒光染料法。熒光定量 PCR具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、線性關(guān)系好等優(yōu)點(diǎn)。
(3)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)
環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在 2000 年由日本學(xué)者 Notomi 等建立。該技術(shù)通過對靶基因的6 個區(qū)域設(shè)計(jì) 4 種特異性引物，利用鏈置換 DNA 聚合酶在等溫條件下經(jīng)過幾十分鐘就可擴(kuò)增出靶序列。這樣克服了 PCR 技術(shù)需要昂貴儀器設(shè)備的缺點(diǎn)，產(chǎn)物在不需任何儀器的條件下就可即時觀察，適合于基層及現(xiàn)場使用。
(4)多重 PCR（Multiplex-PCR）
多重 PCR，又稱復(fù)合 PCR 或多重引物 PCR，其反應(yīng)原理、試劑和操作過程均與一般 PCR 相同。區(qū)別只是在于同一 PCR 反應(yīng)體系中加入 2 對或 2 對以上的引物，同時擴(kuò)增出多個核苷酸片段的方法。多重 PCR 具有高效性、系統(tǒng)性、經(jīng)濟(jì)簡便性等多方面優(yōu)點(diǎn)，能夠快速而準(zhǔn)確的診斷疾病。
