劉海濤 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
目前附紅細(xì)胞體病的診斷方法仍然是顯微鏡檢，包括血液涂片染色鏡檢和直接鏡檢方法，即采取末梢血液制成血液滴片，直接觀察紅細(xì)胞是否變形及附紅細(xì)胞體形態(tài)。鮮血懸滴鏡檢：該方法比較簡(jiǎn)單，是目前診斷附紅細(xì)胞體的主要方法之一。取患畜靜脈血抗凝后，滴一滴與載玻片上，加等量生理鹽水稀釋，在 400倍或者 1000 倍油鏡下觀察，可見紅細(xì)胞邊緣不規(guī)則，呈齒輪狀、星狀等。有的游離于血漿中能夠自由游動(dòng)，翻滾，扭轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。
血涂片染色鏡檢：常用染色方法及染色結(jié)果主要是：吉姆薩染色呈紫紅色，瑞士染色為淡藍(lán)色，吖啶黃染色可見其單體，紅細(xì)胞表面附著的附紅細(xì)胞體數(shù)量不等，并呈各種形式排列。瑞氏染色后，在同一視野中可見附紅細(xì)胞體呈紫紅色、黃褐色、深褐色，有的具有折光性；吉姆薩染色的血片中，附紅細(xì)胞體的大小、形態(tài)、排列以及其它情況均同瑞氏染色，不同之處是著色略有區(qū)別。
電鏡檢查：在透射電鏡下，附紅細(xì)胞體為大小不不等的小體，多為球形。較大的附紅細(xì)胞體上可看到細(xì)長(zhǎng)的纖毛且其表面膜上有突起。掃描電鏡下，發(fā)現(xiàn)附紅細(xì)胞體多為球型，偶見桿狀，單個(gè)或多個(gè)呈小團(tuán)狀附著于紅細(xì)胞表面。紅細(xì)胞表面常見局部凹陷，個(gè)別紅細(xì)胞表面形成洞，有些可見電子密度大的顆粒狀物，無規(guī)則的分布于胞漿內(nèi)。
用于附紅細(xì)胞體病的分子生物學(xué)方法主要為分子雜交、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）以及微孔板雜交-酶免疫法定量檢測(cè)方法。Oberst用噬菌體構(gòu)建了 M.suis 的DNA 文庫(kù)，并篩選出 KSU-2 克隆用 P32標(biāo)記作為診斷用探針，與感染豬附紅細(xì)胞體的豬血提取的 DNA 雜交反應(yīng)較好，且特異性較強(qiáng)，不與未感染豬附紅細(xì)胞體的血液提取 DNA 反應(yīng)。1993 年他又用 PCR-DNA 雜交技術(shù)分別檢測(cè)實(shí)驗(yàn)感染和自然感染豬附紅細(xì)胞體。
Messick首次利用 E.suis 的 16SrRNA gene 保守區(qū)及其多變區(qū)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，該實(shí)驗(yàn)靈敏度較高。張浩吉利用豬附紅細(xì)胞體的 16SrRNA 基因設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增 522bp 的片段，敏感性可達(dá)到 160Pg，但在較低的退火溫度下與豬丹毒絲菌有交叉反應(yīng)。張浩吉建立了 PCR-微孔板雜交-酶免疫法定量檢測(cè)方法。根據(jù) E.suis 的 16SrRNA 基因序列和 Genbank 上的其他各種血營(yíng)養(yǎng)菌比較在保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)通用引物，在下游引物的 5‘端標(biāo)記生物素，PCR 擴(kuò)增出有生物素標(biāo)記的產(chǎn)物，并設(shè)計(jì)了 E.suis的16SrRNA 基因的高變區(qū)的 5‘端地高辛標(biāo)記的探針。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物與鏈霉親和素結(jié)合后與特異性的探針雜交，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體反應(yīng)，底物顯色。通過級(jí)聯(lián)放大，該法的敏感性比常規(guī)的 PCR 方法提高近 100 倍，且沒有交叉反應(yīng)。應(yīng)該說現(xiàn)在分子生物學(xué)方法檢測(cè)附紅細(xì)胞體簡(jiǎn)單，快速，準(zhǔn)確，所以目前最適用于臨床獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。
