楊巍 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
豬流行性腹瀉（PED）與豬傳染性胃腸炎（TGE）的臨床癥狀極其相似，所以僅根據(jù)獸醫(yī)臨床癥狀來診斷 PED 是非常困難的。最初在實驗室中，主要依靠病毒分離、病毒中和試驗和免疫熒光試驗等方法來檢測 PEDV，雖然這些方法都能對 PED 作出準(zhǔn)確的診斷，但是操作復(fù)雜而且耗時長?，F(xiàn)在隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，一些新的實驗技術(shù)逐步被應(yīng)用到 PED 的診斷當(dāng)中。
1 PCR 診斷方法
Ishikawa 等根據(jù) S 基因序列設(shè)計了一對可擴增目的片段長度為 854 bp 的引物，成功地建立了診斷 PEDV 的 RT-PCR 法。此方法 8 小時內(nèi)即可檢測出細胞毒和糞便毒，靈敏度可達 100 TCID50/ml。Kubota等根據(jù) N 基因序列設(shè)計了一對可擴增目的片段長度為540 bp 的引物，成功地建立了診斷 PEDV 的 RT-PCR 法，該方法可進行細胞毒和糞便毒的檢測。在韓國已建立了 TGEV 和 PEDV 的二聯(lián) RT-PCR 診斷方法，可同時檢測出 10 TCID50/ml 的 TGEV 和 PEDV。Kim O 等對免疫組化、原位雜交、RT-PCR 這三種方法的檢測效果進行了比較，認為 RT-PCR 法檢測結(jié)果的重復(fù)性最好。但當(dāng)被檢樣品被福爾馬林固定時，免疫組化和原位雜交這兩種方法效果更好。此外，Kim O 等還建立了鑒別 TGEV 和 PEDV 的多重巢式 RT-PCR 法。
Song 等建立了鑒別診斷 PEDV、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬輪狀病毒（porcine rotavirus, PoRV）的多重反轉(zhuǎn)錄 PCR（Multi-RT-PCR）為鑒別這三種病毒性腹瀉病原的混合感染提供了技術(shù)支持，同時又建立了檢測 PEDV 的實時熒光定量 PCR，對仔豬體內(nèi)PEDV 的病毒載量進行了定量；國內(nèi)的喬憲鳳等以 PEDV 的膜蛋白（M）的 RNA 為模板，根據(jù) Durate 等人發(fā)表的基因序列，設(shè)計了三條位于 PEDV 膜蛋白（M）基因上的引物，來進行 RT-PCR 反應(yīng)，確立了 RT-PCR 最適反應(yīng)條件。 盡管 RT-PCR 法敏感性和特異性都很好，但由于需要特殊的儀器設(shè)備，目前只適合于實驗室診斷，不適合于臨床診斷。
2 ELISA
ELISA 法最大的優(yōu)點是可從糞便中直接檢查 PEDV 抗原，目前應(yīng)用也較為廣泛。朱維正等應(yīng)用雙抗體 ELISA 法從腹瀉病豬糞便中直接檢測病毒抗原，其與電鏡檢查的陽性符合率為 97.37%，陰性符合率為 100%。陳茹等用分離純化的 PEDV 抗原，建立斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗（Dot-ELISA）檢測 PEDV 抗體。采用此方法對 834 份分別來自加拿大、臺灣省進口的種豬和海南省、廣東省種豬群的血清樣進行了檢測，檢測的抗體陽性率達 21%。
與瓊擴試驗相比 Dot-ELISA 更敏感，重復(fù)性更好。 Rodak L 等利用 PEDV M 蛋白的單克隆抗體建立了敏感性強、特異性高的競爭阻斷 ELISA 診斷方法，適于 PEDV 流行病學(xué)調(diào)查；Oh 等建立了間接 ELISA 診斷方法，與病毒血清中和試驗對比證明，該 ELISA 方法具有較高的敏感性和特異性，能用于 PEDV的檢測；Hou 等利用 PEDV 重組 N 蛋白抗原建立了檢測 PEDV 血清的 ELISA 方法，為 PEDV 血清學(xué)檢測提供手段。
3 微量血清中和試驗
林志雄等建立了 PEDV 微量中和試驗。以 PK15（豬腎細胞）作為指示細胞，采用適應(yīng)于傳代細胞生長的 PEDV-G1 株，48 小時即可判定。經(jīng)研究證實本方法檢驗準(zhǔn)確、可靠、具有較高的敏感性，可用于流行病學(xué)調(diào)查。
4 免疫熒光法
直接免疫熒光法（FA）和間接免疫熒光法（IFA）是比較可靠的檢測 PEDV 的特異性診斷方法，目前應(yīng)用也較為廣泛。
崔現(xiàn)蘭等應(yīng)用直接免疫熒光法（FA）檢查病豬小腸的冷凍切片和小腸抹片，對PEDV 人工感染仔豬的檢出率為 91.4%，電鏡觀察陽性率為 47.8%。應(yīng)用間接免疫熒光法（IFA）對 PED 陽性豬血清的陽性檢出率為 89%。林志雄等用適應(yīng)于 Vero、pK15 等傳代細胞的 PEDV-Gl 株建立直接免疫熒光法。用該方法檢測 155 份分別來自 6 個豬場的患有嚴重腹瀉、嘔吐和死亡的仔豬的腸黏膜樣品，檢出率為 52%（81/155），同時用血清中和試驗證實該6 個豬場的仔豬被 PEDV 感染過。應(yīng)用哈爾濱獸研所的熒光抗體方法作為對照，陽性符合率達 95%（19/20），陰性符合率達 90%（9/10）。此方法不和豬傳染性胃腸炎病毒、豬細小病毒、輪狀病毒和大腸桿菌等發(fā)生交叉反應(yīng)，證明該方法具有較高的準(zhǔn)確性和特異性。朱維正等將間接血凝試驗與間接免疫熒光法（IFA）比較后認為 IFA 法更具敏感性，檢測效果更為理想。
5 免疫電鏡法
由于 PEDV 與 TGEV 同屬冠狀病毒，且形狀非常相似，所以二者在普通電鏡下無法進行區(qū)別，因此需要采用免疫電鏡法（IEM）進行區(qū)分。IEM 法既可用已知的 PEDV 高免血清來檢測未知抗原，又可用已知的 PEDV 抗原來檢測未知抗體。王繼科等將抗原和抗體分別經(jīng) 10 000 rpm 離心，免疫復(fù)合物又經(jīng) 12 000 rpm 離心，最后在電鏡下直接觀察到了典型的病毒粒子形成的免疫復(fù)合物，建立了具有三次篩選作用的改良的 IEM 法，具有簡便、直觀、快速和定性正確等優(yōu)點。但該方法由于需要使用電鏡設(shè)備，所以并不適合于大規(guī)模診斷和臨床診斷。
綜上所述，隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，各種分子生物學(xué)技術(shù)的不斷成熟，近年來PED 的診斷方法也得到了很大的改進，但由于受到儀器設(shè)備的限制以及天然 PEDV 的人工培養(yǎng)技術(shù)難度的制約，使很多方法僅限于實驗室診斷階段，還不適用于大規(guī)模的生產(chǎn)實踐。目前已知的各種診斷方法在實際工作中各有優(yōu)缺點，應(yīng)結(jié)合實際情況具體應(yīng)用，互相借鑒，取長補短，定會收到理想的效果。
