劉建波 中國農(nóng)業(yè)科學院
豬輸血傳播病毒流行病的病毒核酸（PCR），其基本原理是以目的擴增DNA分子為模板，加熱變性后分成兩條互補連，加入一對人工合成的與模板特異性互補的寡核苷酸片段，即引物，在低溫退火條件下，引物與模板互補區(qū)域特異性結(jié)合，DNA聚合酶在合適的延伸溫度下，沿模板鏈按照半保留復制機制延伸，合成新的DNA。當這些步驟經(jīng)多次不斷重復，可使目的DNA片段得到大量擴增。DNA的擴增程幾何指數(shù)增加，20~40個循環(huán)后便可獲得大量目的基因片段。PCR應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，包括病原體的檢測，是一種簡便、特異、快速、高效的診斷方法,可以從各種細胞培養(yǎng)物、組織以及中血液擴增出目的基因片段，經(jīng)電泳后得出診斷結(jié)果，該方法在傳統(tǒng)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上得到了充分的發(fā)展，目前已根據(jù)其原理建立了如PCR、多重PCR、環(huán)介導恒溫擴增PCR、巢式PCR、定量PCR和競爭PCR等。
1 聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）
自1997年Nishizawa首次獲得TTV病毒的基因組以來，建立了TTVs的PCR檢測方法。由于其設(shè)計的引物N22位于ORF1的高變異區(qū)域，以其作為引物進行檢測。由于引物的特性，只能檢測出其同種型的TTV基因群，卻不能檢測出TTV的不同基因群，因而不能充分反映TTV的實際感染情況。針對上述缺陷，Takahashis等根據(jù)基因組中的保守的UTR區(qū)域設(shè)計引物，建立了PCR檢測方法，能檢測出已知不同基因型的變異株，TTV的陽性檢出率明顯高于用N22 PCR的檢測結(jié)果。2002年，Okamoto根據(jù)人TTV基因組的非編碼區(qū)設(shè)計引物，成功地在豬、狗、貓體內(nèi)擴增到TTV基因組，推斷TTV有種屬特異性。之后，國內(nèi)外學者根據(jù)GenBank上登錄的PTTV基因組序列設(shè)計一系列引物，建立了諸多PCR檢測方法，用于PTTV的流行病學調(diào)查。Segalés根據(jù)PTTV基因組中的保守區(qū)域設(shè)計引物建立檢測PTTV1和PTTV2的診斷方法，對1985年至2005年間的病料樣品進行檢測，陽性結(jié)果為PTTV1陽性率為33.3% (54/162)，PTTV2陽性率為55.6%（90/162），PTTV1和PTTV2共感染率為23.5%（38/162）。檢測結(jié)果可知，目前已知PTTV的最早感染可追溯到1985年。
2 套式PCR
套式PCR也稱巢式PCR（Nested PCR）。套式PCR技術(shù)普通PCR技術(shù)的原理相同，但有別于普通PCR。PCR的出現(xiàn)為研究樣品中極微量基因提供了一個特異而強大的工具，在某些情況下仍然有不足之處。很多目的基因，由于其模板量較少，用一對引物進行PCR擴增后，產(chǎn)物仍不能通過凝膠電泳進行觀察。針對這種情況，套式PCR技術(shù)應(yīng)運而生，它共需要經(jīng)2輪PCR擴增和每輪分別利用一對引物對來完成，首先用第一對引物對靶DNA進行擴增，然后以第一次PCR產(chǎn)物為模板進行第2次擴增，第2次PCR引物與第1次反應(yīng)產(chǎn)物的內(nèi)部序列互補，第2次擴增產(chǎn)物即為目的產(chǎn)物，其擴增片段短于第1次的擴增產(chǎn)物。巢式PCR的好處在于，如果第1次擴增產(chǎn)生了錯誤片斷，則第2次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低。該方法可以提高敏感性和特異性。王礞礞 等利用套式PCR法檢測了江西、廣東、福建等7個省份的280份組織樣品和血液樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)我國豬群中存在PTTV1和PTTV2感染，陽性率分別高達37.6%和82.6%，PTTV1和PTTV2的混合感染率為34.5%。
3 熒光定量PCR
鑒于PCR和巢式PCR只能從定性方面來檢測PTTVs，而不能從量的方面來確定病毒的載量，許多學者建立了熒光定量PCR（real time PCR，rt-PCR）檢測PTTV方法。熒光定量PCR根據(jù)所用材料不同分為探針法和染料法。Andreas根據(jù)PTTVs基因組在非編碼區(qū)設(shè)計了能夠分別擴增PTTV1和PTTV2引物，并設(shè)計rt-PCR的探針：3’末端均有MGB淬滅集團，PTTV1探針的5’端用FAM標記，而PTTV2的5’端用VIC標記，并用建立的rt -PCR對203份豬血清樣品進行了PTTVs檢測，結(jié)果顯示，PTTV1、PTTV2單獨感染和PTTV1、PTTV2混合感染陽性率分別為32%、17%、32%，該檢測結(jié)果與普通PCR方法相符。陳欣等根據(jù)PTTV基因組保守區(qū)域分別設(shè)計兩對特異性引物，建立了SYBR-Green I二重熒光定量PCR，結(jié)果顯示該方法具有很好的特異性、重復性，最低檢出量為10 copies/ml。
