張樂宜 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
豬葡萄球菌引起的滲出性皮炎因其臨床癥狀而被認(rèn)識已 160 多年。所有主要養(yǎng)豬國家都報道了 EE，并在某些地區(qū)發(fā)病率不斷增高。這種增高反映了畜牧生產(chǎn)集約化、規(guī)?；?，早期斷奶，動物密度增加等變化。很多養(yǎng)豬業(yè)較發(fā)達(dá)的國家均已對本國的滲出性皮炎進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，并展開關(guān)于豬葡萄球菌的快速診斷、致病機(jī)理及防制等全方面的研究工作。以前對該屬的鑒定和分類只局限于用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)以及生化試驗進(jìn)行分類和鑒定。
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們開始采用基因工程的方法對不同物種進(jìn)行基因序列分析和生物信息學(xué)分析，從而對物種進(jìn)行正確的鑒定和分類。目前國外關(guān)于葡萄球菌及其毒素的檢測方法包括 16S rRNA 的 PCR 檢測，Gap基因的 PCR 檢查及脫落毒素基因的 PCR 檢測。16S-23S rRNA 及 16S rRNA 是目前使用最為普遍的鑒定物種的方法。16S rRNA 和 PCR-RFLP 對葡萄球菌屬進(jìn)行鑒定已有報道。
Forsman 等應(yīng)用 16S-23S rRNA 成功將引起牛乳腺炎的葡萄球菌與鏈球菌進(jìn)行了區(qū)分；Takahashi 等應(yīng)用 16S rRNA 對葡萄球菌進(jìn)行了種屬分類，將 38 個種屬的葡萄球菌分為12個分類簇；Bentley等通過分析16個種屬的葡萄球菌的16S rRNA的序列，發(fā)現(xiàn)了一個金黃色葡萄球菌特異性區(qū)域，在此基礎(chǔ)上合成了一條補(bǔ)充性的寡核苷酸探針，成功將 18 種葡萄球菌進(jìn)行了種屬分類。16S rRNA 基因序列的分析已經(jīng)越來越多被用作葡萄球菌進(jìn)化和分類的一種方法。但是這種方法也存在它的缺陷性，這種方法的分類結(jié)果往往與多相分類學(xué)的分類結(jié)果不一致，一些相關(guān)性比較近的葡萄球菌往往很難被區(qū)分開來。新的檢測方法急待建立，Gap 基因調(diào)控一個位于葡萄球菌細(xì)胞壁上的 42-KDa 的轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tpn)，Tnp 是新出現(xiàn)的與細(xì)胞壁相關(guān)的甘油醛三磷酸脫氫酶有關(guān)的蛋白質(zhì)。甘油醛三磷酸脫氫酶在催化 D-glyceraldeyde-3-phosphate 轉(zhuǎn)化為二磷酸甘油酸過程中起著重要的作用。Gap 在這個過程中被想象成一個管家基因。
目前許多研究者已開始采用 Gap 基因作為鑒別診斷葡萄球菌屬的一種方法，有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn) Gap 基因的部分序列可以作為分子水平上的葡萄球菌屬分類鑒定工具，它可以減少誤判的可能性。通過對比可以看出，Gap 基因在葡萄球菌的鑒定和分類學(xué)上的準(zhǔn)確性等特點要優(yōu)于利用 16s rRNA。Ghebremedhin B 等應(yīng)用不同的基因檢測方法開展了對葡萄球菌屬的遺傳分類和區(qū)別，他們利用 Gap 基因在臨床分離到了 27株葡萄球菌，通過建立的系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果顯示葡萄球菌屬各個亞種之間的同源性為 24.3～96%，而其他幾個基因各個亞種之間的同源性分別為 16S rRNA（97%）、rpoB(86%)、hsp60 (82%)、sodA (78%)。
研究結(jié)果顯示，以 Gap 基因的部分序列作為葡萄球菌屬多相分析的一個分子工具可有效降低葡萄球菌屬分類過程中的錯誤識別現(xiàn)象。豬葡萄球菌脫落毒素的產(chǎn)生是S.hyicus毒力最重要的決定因素之一，因此對脫落毒素進(jìn)行調(diào)查研究也顯得至關(guān)重要，脫落毒素的檢測是闡明豬滲出性皮炎流行狀況的一個重要指標(biāo)。國外在豬葡萄球菌脫落毒素的檢測方面也開展了較多研究，AndresenLO等通過多重PCR對編碼豬葡萄球菌脫落毒素的基因進(jìn)行了檢測，針對四種不同的表皮脫落毒素ExhA，ExhB，ExhC and ExhD分別設(shè)計特異性引物，對分離自患豬滲出性皮炎的豬只的314株豬葡萄球菌分離株進(jìn)行了篩選，研究結(jié)果顯示，ExhA、ExhB、ExhC and ExhD的檢出率分別為20%、33%、18%和22%。同時，他們通過多重PCR方法對豬葡萄球菌進(jìn)行鑒定，篩選出含有毒素基因的菌株來制備滅活疫苗來預(yù)防和治療豬滲出性皮炎。
目前，豬滲出性皮炎的發(fā)生在國內(nèi)已有較多報道。鄧朝陽，甘海霞等于 2001年報道了廣西某豬場發(fā)生的滲出性皮炎的流行狀況及治療情況，殷鳳斌，米瑞娟等在 2002 年報道了發(fā)生在東北的豬滲出性皮炎的病原鑒定，睢艷平，徐鑌蕊等在 2006年報道該病在北京的發(fā)病情況，段曉軍等2009 年報道在河北省永清縣某豬場發(fā)生了豬滲出性皮炎，段玉鵬等2010 年報道寧夏海原縣某豬場出現(xiàn)仔豬葡萄球菌病的發(fā)生。以上研究報道顯示該病已在我國豬群中廣泛存在，已成為影響我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要疫病之一。但由于該病未被列入重大傳染病目錄，其危害長期以來被忽視，因此相關(guān)研究在國內(nèi)基本處于空白狀態(tài)，目前，國內(nèi)對豬滲出性皮炎的報道只限于其病原菌的分離鑒定和抗生素治療，而對該病的病原學(xué)、發(fā)病機(jī)理及診斷方法等方面的研究尚處于空白，國內(nèi)目前尚無葡萄球菌屬的鑒定方法及豬葡萄球菌表皮脫落毒素的檢測方法的報道，所以對豬滲出性皮炎的流行情況調(diào)查缺乏一個合理的評估方法。
張曦等人分離了多株菌株，對這些菌株進(jìn)行了生化反應(yīng)，16S rRNA 鑒定，對分離菌株進(jìn)行了致病性試驗；建立了細(xì)菌及其毒素感染的裸鼠模型；在大腸桿菌中進(jìn)行了豬葡萄球菌部分毒素基因的表達(dá)，研究了表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性，部分分離菌株正在進(jìn)行快速診斷方法和疫苗的研究。國內(nèi)開展此方面研究的還有鄭世軍課題組，他們發(fā)現(xiàn)松鼠葡萄球菌是引起豬滲出性皮炎的新病原，該病原菌攜帶 ExhC 和四種耐藥基因，明確了該毒素的活性區(qū)域和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)理并獲得中和該毒素的高親合力單抗。
