張樂宜 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
葡萄球菌產(chǎn)生的脫落毒素可以引起人和動物發(fā)生嚴重的皮膚性疾病。例如金黃色葡萄球菌可引起人的燙傷樣皮膚綜合癥，豬葡萄球菌可引起仔豬發(fā)生滲出性皮炎。目前發(fā)現(xiàn)的脫落毒素有 8 種，包括金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的 ETA、ETB 和 ETD，以及豬葡萄球菌產(chǎn)生的 EXHA、EXHB、EXHC 和 EXHD、SHETA、SHETB。
表皮脫落毒素是豬滲出性皮炎致病機理中的關(guān)鍵因素。脫落毒素是一種細胞外蛋白質(zhì)，分子量大約 30KD ，由丹麥研究者發(fā)現(xiàn)的脫落毒素分為 4 種類型分別命名為ExhA、ExhB 和 ExhC，還有一種在抗原性與上述蛋白有顯著不同的脫落毒素被稱為ExhD。在日本 HISAAKI SATO 等(1999)發(fā)現(xiàn)并純化的脫落毒素(Staphylococcushyicus Exfoliative Toxin, SHET)有 2 種類型，分別命名為 SHETA 和 SHETB。
Peter Ahrens等人對S.hyicus中編碼脫落毒素ExhA、ExhB、ExhC和ExhD的基因分別進行了克隆和測序。他們發(fā)現(xiàn)編碼這四種脫落毒素的基因從816bp到834bp不等。四種脫落毒素的氨基酸序列也與先前報導(dǎo)的豬葡萄球菌的SHETB和金黃色葡萄球菌的ETA、ETB 和ETD具有同源性。豬葡萄球菌與金黃色葡萄球菌處于同一水平的同源性。ExhA、ExhB和ExhC在絲氨酸酶催化位點的保守性上具有相似性，但是在EXHD中，推定的催化位點上由Glu替代了原來的Asp。另外，這些脫落毒素可以在大腸桿菌中進行重組表達，其中3/4的毒素可以與利用脫落毒素制備的單克隆抗體結(jié)合。
Lars Ole Andresen ，丹麥獸醫(yī)實驗室，從1997年8月到1998年5月利用建立的間接ELISA對69個豬場的655頭豬進行了調(diào)查。每個豬場的發(fā)病率為74%，同時實驗表明從豬群體中分離到的豬葡萄球菌菌株99%含有毒素基因。其中含毒素的為51株，不含毒素的菌株為18株(26%)。他們發(fā)現(xiàn)在含有毒素基因的EXHA、EXHB的培養(yǎng)液中加入二價的鋅離子鹽和鈷離子鹽類能提高對含有這兩種毒素的菌株的檢出率。單獨加入鋅離子能提高含有EXHC毒素基因的菌株。其結(jié)果顯示加入二價金屬離子的培養(yǎng)基所產(chǎn)生的脫落毒素量要比未加入金屬離子的高出很多；而當在含有二價金屬離子的培養(yǎng)基中加入金屬離子螯合物時，脫落毒素的產(chǎn)量大幅減少。上述實驗結(jié)果說明脫落毒素ExhA和ExhB的產(chǎn)生是金屬依賴性。另外，研究發(fā)現(xiàn)通過免疫印跡試驗也可以對不同毒株產(chǎn)生的毒素進行鑒別。
Y Fudaba 等人發(fā)現(xiàn)豬葡萄球菌脫落毒素能夠選擇性消化 Desmoglein(Dsg)。在實驗中，他們對所有的脫落毒素，包括：ExhA、ExhB、ExhC、ExhD 以及金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的 ETA 和 ETB 進行了克隆和表達，并將 ExhA、ExhB、ExhC、ExhD 分別注入豬體內(nèi)后，能夠引起豬表皮出現(xiàn)水皰和結(jié)痂。動物體的表皮細胞表面通常被Desmoglein-1 覆蓋，而不是 Desmoglein-3，當正常的豬表皮細胞被脫落毒素感染的時候 Desmoglein-1 被完全消化。純化的毒素蛋白在仔豬皮膚上可以引起與 EE 相類似的病變，純化毒素的作用是使表皮中細胞分離，特別是使上部的棘細胞層中的細胞分離，從而使細菌在表皮中迅速擴散，皮膚脫落并伴有大量皮脂分泌物和漿液分泌物。
Wegener HC在丹麥，對從患有滲出性皮炎的仔豬身上分離到的豬葡萄球菌進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些菌株含有不同的噬菌體類型、質(zhì)粒圖譜、抗生素的耐藥模式。用這些含有毒素的菌株注射仔豬進行試驗時將其進行了分型，大致分為能產(chǎn)生滲出性皮炎的帶毒株和皮膚真皮層不發(fā)生改變的無毒株。并且發(fā)現(xiàn)帶毒株和無毒株同時存在于發(fā)病豬，這給診斷該病帶來了很大的困難。用9株帶毒菌株培養(yǎng)的濃縮上清液給健康仔豬進行皮下注射，所有實驗組的仔豬都出現(xiàn)蛻皮癥狀。通過組織病理學(xué)方法觀察和檢測，發(fā)現(xiàn)皮膚的外殼發(fā)現(xiàn)棘皮層增厚。用9株無毒株培養(yǎng)濃縮的上清液組的仔豬的皮膚無眼觀變化或微觀變化。
目前，所有能引起皮膚發(fā)生病變的濃縮上清液中毒素蛋白的分子量大約為30KD。在不能檢測到樣品中未發(fā)生皮膚變化時，沒有發(fā)現(xiàn)其他蛋白具有類似協(xié)同作用?？傊?，臨床上可以通過有結(jié)痂反應(yīng)的仔豬作為判定帶毒株引起的仔豬滲出性皮炎的合適指標，帶毒株的豬葡萄球菌產(chǎn)生毒素蛋白的分子量大小約30KD。而無毒株菌株培養(yǎng)的上清液中則不含有該毒素蛋白。
Tanabe T在日本從健康豬和發(fā)生豬滲出性皮炎的豬群中分離了豬葡萄球菌，其中從8個感染豬滲出性皮炎的豬場分離到了37株豬葡萄球菌，從兩個健康的保育豬場分離到131株豬葡萄球菌。從感染滲出性皮炎的豬群中分離豬葡萄球菌比率為100%，健康豬群為35.4%。同時，對分離到的菌株進行分離培養(yǎng)和生化鑒定。他們用培養(yǎng)液的上清感染 1 日齡小雞后出現(xiàn)皮炎癥狀。而且分離到的大多數(shù)菌株都產(chǎn)生 SHET 脫落毒素，其中從感染的豬群中分離到的菌株產(chǎn)生 SHET 毒素的比例為87.5%；從健康豬群中分離到的菌株產(chǎn)生 SHET 脫落毒素的比例為 76.1%。他們通過免疫瓊脂擴散試驗，將 SHET 脫落毒素分為兩個血清型。并利用產(chǎn)生毒素和不產(chǎn)生毒素的菌株進行動物實驗，不產(chǎn)生毒素的菌株皮下注射 48h 觀察結(jié)果，另外一組皮下注射產(chǎn)生毒素的菌株 7 日后觀察結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射產(chǎn)生毒素菌株培養(yǎng)液的仔豬出現(xiàn)典型的臨床癥狀，皮炎，蛻皮，結(jié)痂。而不產(chǎn)生毒素的菌株無任何臨床癥狀。
Hisaaki Sato證明了金黃色葡萄球菌和豬葡萄球菌產(chǎn)生的兩種脫落毒素蛋白分子受染色體和質(zhì)?？刂?，并根據(jù)其血清學(xué)將這些毒素的種類一一命名。同時根據(jù)分子量大小又將其分為不含質(zhì)粒的 SHETA(P-1)菌株和含有質(zhì)粒的(P-10，P-23)SHETB 菌株，SHETA 血清型可以使 1 日齡的小雞表皮脫落，豬葡萄球菌的 P-23plasmid-cured 的亞系(P-23C1 和 P-23C2)能使 1 日齡的小雞發(fā)生表皮脫落，而 P-10 亞系(P-10C1 和 P-10C2)能夠使 1 日齡的小雞發(fā)生表皮脫落，但是，他們都能降低剝落能力的活性。研究還發(fā)現(xiàn)，P-10 菌株除分泌合成 SHETA 以外還分泌合成 SHETB，而 P-23 菌株僅分泌合成 SHETB。攜帶質(zhì)粒的菌株(P-23)和不攜帶質(zhì)粒的菌株(P-1)引起仔豬發(fā)生滲出性皮炎在臨床上出現(xiàn)的癥狀是一樣的。而 P-23 菌株的 plasmid-cured亞系引起的豬滲出性皮炎在臨床上無任何典型的征兆。另外發(fā)現(xiàn) SHETA 的分泌合成受染色體的控制，而 SHETB 的分泌受質(zhì)粒的控制，因此，將產(chǎn)生 SHET 脫落毒素的菌株分為 3 類：SHETA-producing strains，SHETB-producing strains，strains producingboth toxins。Amtsberg 研究表明豬葡萄球菌的培養(yǎng)物能產(chǎn)生一種外毒素，能夠引起仔豬滲出性皮炎。這種外毒素的剝落活性與金黃色葡萄球菌產(chǎn)生 ETS 脫落毒素很相似。
Talah Kanbar對在俄羅斯流行的23株、德國的17株菌株中對含有毒素SHETA、SHETB的菌株利用PCR技術(shù)進行了鑒定。其中檢測到16株含有毒素SHETA。另外SHETA陽性的毒株同時也能檢測到EXHD和EXHC脫落毒素的編碼基因。
楊彩娟等對EXHB全基因進行了測序，證明了本實驗室分離到的菌株與國外分離到的菌株同源性達97.4%，并對構(gòu)建的重組載體進行了誘導(dǎo)純化，獲得了一條45KD大小的目的蛋白片段，他們發(fā)現(xiàn)EXHB基因的免疫原性明顯優(yōu)于其他三種基因。同時對裸鼠進行了致病性試驗研究，結(jié)果表明EXHB基因?qū)︻A(yù)防豬滲出性皮炎起著極其重要的作用。張曦，楊鼎等從EXHB基因的N端和C端重新設(shè)計引物進行PCR擴增，構(gòu)建重組載體獲得了一條大約30.7KD大小的蛋白目的片段，他們通過ELISA實驗證實N端基因分泌的蛋白免疫原性優(yōu)于C端基因分泌的目的蛋白。
