曹齊樹 華中農(nóng)業(yè)大學
近幾年來，慢病毒載體逐漸發(fā)展成熟，己成為畜牧研究中表達載體的主導，主要是因為其具有獨特的優(yōu)勢。慢病毒載體與其它表達載體相比，最大的優(yōu)勢是它們能感染分裂和非分裂的細胞，能夠解決轉(zhuǎn)染效率低的問題;另外慢病毒載體可以使得所攜帶的目的基因在宿主細胞中得到長期穩(wěn)定的表達;還有就是經(jīng)過改造的慢病毒載體可以容納約10kb大片段外源基因，并且可以有多個轉(zhuǎn)錄啟動子。慢病毒載體的這些優(yōu)點使其成為了體內(nèi)和體外基因轉(zhuǎn)移乃至轉(zhuǎn)基因動物研究的一種有效工具。
1 慢病毒載體基本結(jié)構(gòu)
慢病毒(Lentivirus)屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retrovidae)，是RNA病毒。慢病毒載體以HIV-1型最為常用，還有HIV-2型載體系統(tǒng)，猿類免疫缺陷病毒(sIV)，貓免疫缺陷病毒(FIV)等。
HIV-1型慢病毒載體的構(gòu)建過程主要是去除野生型病毒基因組中的致病基因和3’端LTR中的全部U3序列，使得LTR區(qū)的轉(zhuǎn)錄激活能力下降，形成了自我滅活型載體系統(tǒng)。這個系統(tǒng)去除了致病基因，保證了載體的生物安全性。復制缺陷型HIV載體通過水泡口炎病毒(vesicular stomatitisvirus)G糖蛋白(VSv-G)來替代扭v-l型載體中的包膜蛋白進行包裝。不僅使其更安全，宿主范圍更廣，而且還能增加病毒的滴度。
將編碼病毒衣殼和包膜結(jié)構(gòu)的基因分別克隆于另外兩個質(zhì)粒中，然后將這兩個質(zhì)粒與基因組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細胞就可以產(chǎn)生重組慢病毒。慢病毒載體系統(tǒng)主要是由三種不同質(zhì)粒構(gòu)成，分別是轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，輔助質(zhì)粒和包膜表達質(zhì)粒。轉(zhuǎn)移質(zhì)粒主要是用來插入外源目的基因，同時也保留了對病毒的整合復制起主要作用的元件。輔助質(zhì)粒主要包括gag、pol和rev蛋白，gag主要是編碼病毒的核心蛋白，pol則主要編碼病毒復制過程中所需要的酶，而rev蛋白則參與編碼班V結(jié)構(gòu)蛋白m丑NA的核一漿轉(zhuǎn)運過程。
慢病毒載體的發(fā)展經(jīng)歷了三個階段，每個階段的改造均是為了考慮載體的生物安全性，目前常用的有載體是由Invitrogen和Clontech兩個公司生產(chǎn)的。生物安全性更高的是四質(zhì)粒系統(tǒng):插入目的基因的pLenti表達載體;表達慢病毒結(jié)構(gòu)所必需的gag基因以及病毒復制和整合必需的pol的pLPI質(zhì)粒;表達Rev蛋白的pLPZ質(zhì)粒水泡炎病毒G糖蛋白(VSV-G)，讓宿主范圍更廣。這四個質(zhì)粒共同作用才能夠產(chǎn)生有感染力的病毒粒子。
2 慢病毒載體的應(yīng)用
慢病毒載體技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動物的研究上起到了重要的作用，目前轉(zhuǎn)基因小鼠、大鼠以及轉(zhuǎn)基因豬都有報道。轉(zhuǎn)基因豬的成功制備對目前醫(yī)學上供體器官的短缺提供了可持續(xù)的幫助。另外，相關(guān)的實驗也證實了慢病毒載體在癌癥的治療和抗HIV等疾病方面都有一定效果?？梢詫⒙《据d體技術(shù)結(jié)合RNAI技術(shù)用于基因治療，并且還可以研究細胞中特定基因的功能，這是功能基因組研究領(lǐng)域的又一大突破。改造載體系統(tǒng)中的包膜質(zhì)粒可以研究包膜蛋白的功能及其與宿主細胞的互作，這在冠狀病毒等研究上已有報道。另外已有研究成功構(gòu)建了JEVE基因的假病毒，且目前假病毒的研究也有很多報道，這對本實驗在理論和技術(shù)上有一定的指導性幫助。
