董建國 中國農(nóng)業(yè)科學院
1 命名與活性中心
套式病毒3C樣蛋白酶（3C-like protease, 3CLPro）底物結合袋中His殘基為一必須的殘基，決定底物酶切位點P1位為何種殘基。在冠狀病毒中，其主要蛋白酶稱為3CLPro，該蛋白酶有一雙β折疊桶結構，由12個β折疊片所組成。最早是在細胞內(nèi)絲氨酸蛋白酶（糜乳蛋白酶）中發(fā)現(xiàn)具有這種桶狀結構，故套式病毒3CLPro又被稱為類糜乳蛋白酶。與冠狀病毒的3CLPro不同，在動脈炎病毒中，主要蛋白酶使用絲氨酸（Ser）作為識別底物催化位點的催化殘基，故動脈炎病毒中的主要蛋白酶又可稱為3C樣絲氨酸蛋白酶（3C-like serine protease, 3CLSP）。應用分子生物學軟件進行序列同源性分析，結果顯示冠狀病毒3CLPro與其同屬的動脈炎病毒的3CLSP之間的序列同源性較低，且僅在酶活性位點殘基區(qū)域有較高同源性。
經(jīng)過序列比對分析，結果顯示冠狀病毒3CLSP的催化系統(tǒng)與其他病毒的3C樣蛋白酶相似，推測表明它們均使用催化3聯(lián)體（His-Asp（Glu）-Cys）作為酶活性中心。根據(jù)預測的結果，通過點突變研究，結果顯示這3個氨基酸殘基的突變直接導致冠狀病毒3CLSP活性的喪失，故這些aa是3CLSP必須的。用Ser代替IBV活性位點的Cys后進行順式切割試驗，發(fā)現(xiàn)突變的3CLSP仍然具有部分的酶活性，顯示冠狀病毒的3CLSP和動脈炎病毒的親緣關系較高。但在MHV和Hcov病毒中，將3CLSP Cys突變?yōu)镾er后，對應的的突變體的酶活性喪失。據(jù)現(xiàn)在的研究充分顯示，冠狀病毒3CLSP中保守性的氨基酸殘基His和Cys充當了親核殘基；在3C蛋白酶和3CLpro中，Ser被Cys代替作為親核殘基；在有些病毒的，細胞源蛋白酶中的催化3聯(lián)體中的Asp被Glu代替。動脈炎病毒中的3CLSP催化3聯(lián)體為His-Asp-Ser，冠狀病毒不同于動脈炎病毒，使用的是催化2聯(lián)體：由Cys與His組成。通過大量突變實驗，結果顯示，與其它3C蛋白酶或3CLSP催化3聯(lián)體不同，冠狀病毒的3CLSP的催化位點由Cys與His 2聯(lián)體組成，缺少1個酸性催化殘基Glu或Asp與之相對應。在非典型性肺炎病毒（SARS-CoV）、豬傳染性胃腸炎病毒3CLSP的晶體結構實驗中，證實了這一點。
在SARS-CoV3CLSP、TGVE的晶體結構實驗中，發(fā)現(xiàn)有1個水分子位于動脈炎病毒第3個催化殘基（Glu或Asp）的位置，這個水分子和周圍的3個aa：His41、Asp186、His163形成氫鍵，從而可能起到與Aps類似的功能。馬動脈炎病毒（EAV）3CLSP使用催化3聯(lián)體His-Asp-Ser作為催化位點，通過實驗證實這些氨基酸殘基構成3CLSP酶活性必需的，突變會導致酶活性喪失。已有實驗表明PRRSV同EAV一樣，也使用催化3聯(lián)體His-Asp-Ser作為活性中心，這些位點的改變可使該酶的活性喪失。
2 底物酶切位點的特異性
3CLSP的底物是病毒基因組所表達的多聚蛋白ppla和pplab。依照習慣，從切點開始N端的aa殘基依次稱為P1，P2，P3…，底物切點C端的aa殘基依次稱為P1’，P2’，，P3’…。在底物特異性方面，冠狀病毒的3CLSP與其它的3CLSP相似。底物酶切位點的Pl位為Glu，Pl’位為小分子脂肪族aa殘基，如Gly、Ser、Ala。當Pl’位為大分子aa殘基（如Asn）時，3CLSP酶切活性則會降低。P2位一般為Leu，有時P2位也會有其它一些疏水性aa殘基，如Met、Phe、Ilu、Val。而一些小分子aa殘基常位于P4位，如Ala、Pro、Val、Thr、Ser。
通過aa序列的比對分析，EAV 3CLSP水解病毒自身表達的多聚蛋白的切割位點已被確定。其總共酶切位點至少有8個，已鑒定出的位于ORFla編碼的ppla上的有5個，位于ORFlb編碼的pp1ab上的有3個。這些酶切位點中有4個在Glu-Gly間，3個在Glu-Ser間，1個在Gln-Ser間。在所有動脈炎病毒序列中，這些酶切位點都很保守。此外，推測結果顯示Lys或Ala位于Pl’的位置上。研究還發(fā)現(xiàn)除Pl-P1’之外，位于P2、P4上的aa殘基序列也存在一定的保守性，這說明這些位點的aa殘基與EAV 3CLSP對底物的特異性識別有關，有利于3CLSP識別底物。EAV中Thr-1179、His-1199aa殘基相當保守，研究認為這2個aa在3CLSP識別底物時發(fā)揮關鍵作用，從而決定P1位aa殘基Glu（Gln）的特異性。故有學者認為3CLSP的原型是EAV 3CLSP。根據(jù)序列比對，推測PRRSV 3CLSP在pp1a和pp1ab上的酶切位點有8個，其中5個位于ORFla編碼的ppla上，3個位于ORFlb編碼的pp1ab上。PRRSV 3CLSP在多聚蛋白的酶切位點中有6個位于Glu-Gly間，1個位于Glu-Ser間，1個位于Glu-Ala間。這些切割位點在所有PRRSV序列上都是相當保守的。研究表明用Gln代替Nsp11和Nsp12之間的切割位點Glu后，3CLSP不能識別底物，故Nsp11和Nsp12之間的Glu是3CLSP識別底物的特異性位點。除Pl-P1’之外，P2、P4位上的a（aLeu、Phe）有一定的保守性，這說明這些位點的aa殘基與PRRSV 3CLSP對底物的特異性識別有關。
3. 巢狀病毒主要蛋白酶的 3D 結構
依據(jù)報道，目前5種屬于套式病毒的3CLPro的晶體結構已經(jīng)被解析，分別是:HCoV 3CLPro、SARS-CoV 3CLPro、EAV 3CLPro、TGEV 3CLPro和PRRSV 3CLPro。他們的3CLPro的晶體結構由3個結構域組成，結構與EAV 3CLPro很相似。N端雙β折疊桶由2個結域構組成，2個結構域中間有一裂隙，而蛋白酶的活性中心就存在這一裂隙中。C端結構域的改變將導致酶催化活性的喪失，但具體生物功能有待于進一步研究。雖然冠狀病毒3CLPro具有糜蛋白酶樣折疊（絲氨酸蛋白酶家族），但是其催化中心僅由His及Cys 2聯(lián)體組成，而不是由Ser、His、Aps組成的標準3聯(lián)體,此標準3聯(lián)體屬于絲氨酸蛋白酶家族。而EAV和PRRSV 3CLPro的活性中心由3聯(lián)體（Ser-His-Asp）組成。
在5種已解析的3CLPro晶體結構中，3種冠狀病毒的3CLPro有C2對稱性，呈現(xiàn)2聚體形式。SARS-CoV 3CLPro的晶體結構，由1個單體的結構域Ⅱ構成凹槽，另1個單體N-Finger位于這一凹槽中，且它的N1位aa殘基Ser的HN-基團與和它結合的單體的aa殘基Phe-140、Glu-166的基團形成氫鍵。于是研究者認為2個單體的的這種相互作用方式可能是構成3CLPro催化中心所必需的，有助于酶與底物酶切位點的特異性結合。后來，有學者通過實驗證明N末端在維持SARS-CoV 3CLPro催化中心的構象是必須的，N末端aa的缺失將導致酶活性喪失，但并不影響3CLPro 的二聚化。有研究者發(fā)現(xiàn)把TGEV 3CLPro N末端1-5個aa殘基截去，則該蛋白酶的水解活性就會喪失。從結構可得出，結構域Ⅲ有助于維持loop184-199和結構域Ⅱ之間的取向，從而形成特定的空間構象便于催化底物。實驗結果顯示SARS-CoV3CLPro的C端在構成酶二聚化時是必須的。該蛋白的二聚體形成與其在溶液中的溶度有關：把該蛋白結構域Ⅲ截去后，即使蛋白濃度很高（14.88mg/mL），蛋白也無法形成二聚體，且沒有催化活性；而結構域Ⅲ單獨表達時，即使蛋白溶度很低（0.12mg/mL），蛋白也能形成二聚體，但是該蛋白也沒有催化活性。故試驗表明結構域Ⅲ有助于SARS-CoV 3CLPro二聚體的形成。
PRRSV 3CLSP有3個結構域組成，包括由2個反向平行的β折疊桶和1個額外C末端α/β區(qū)域構成。N末端β折疊桶（結構域Ⅰ）由6個β片（aI to fI）和1個短的α螺旋組成，中間的β折疊桶（結構域Ⅱ）由7個β片（aII to gII）組成，通過1個長的loop環(huán)（aa69-89）與結構域I連接。催化位點由保守的Ser118, His39, 和Asp64組成，位于結構域Ⅰ和Ⅱ之間的裂隙中，額外的C末端（結構域Ⅲ）由157～199殘基和兩對短的反向平行的β片層（aIII–cIII和bIII–dIII）和兩個α螺旋組成。
螺旋B和螺旋C的角度約90°。一個長的N末端loop環(huán)越過結構域Ⅱ延伸到結構域Ⅲ附近。這個loop環(huán)的方向由3個氫結合Arg4 N…Glu100 OE1，Thr5 N…Val99 O和Thr5 OG1…Val99 N所固定。Phe3位于結構域Ⅱ和Ⅲ間的疏水性表面，因此，它也有利于穩(wěn)定N末端loop環(huán)的方向性。
