謝飛 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
1.消化道微生物的傳統(tǒng)分離培養(yǎng)
傳統(tǒng)的消化道微生物研究以微生物的分離培養(yǎng)為基礎(chǔ)，利用各種培養(yǎng)基分離培養(yǎng)腸道微生物菌株，然后對(duì)各種菌株進(jìn)行單一或者組合共培養(yǎng)，研究細(xì)菌個(gè)體或菌群間的相互作用及功能。雖然在過去近半個(gè)世紀(jì)里傳統(tǒng)技術(shù)取得了許多重大進(jìn)展，如厭氧培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)明使用，動(dòng)物模型的建立以及無菌動(dòng)物的應(yīng)用等，然而畜牧研究顯示胃腸道中可培養(yǎng)的細(xì)菌占腸道總細(xì)菌的比例仍然只是少數(shù)，絕大多數(shù)腸道微生物難以在腸道外部培養(yǎng)，而且相關(guān)研究易丟失微生物多樣性、不能準(zhǔn)確的反映腸道微生態(tài)的多樣性，且大量具有科研和應(yīng)用價(jià)值的新基因由于存在于難以培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的微生物中，而無法被研究和利用:其次，通過體外培養(yǎng)研究以及相互組合共培養(yǎng)研究，并不能真實(shí)反映其在腸道內(nèi)部的生理生化反應(yīng)，與實(shí)際復(fù)雜的腸道環(huán)境有較大差異，結(jié)果也存在一定的誤差。這些方法均不能全面真實(shí)地反映腸道微生物區(qū)系的功能，這都在一定程度上影響了對(duì)腸道微生物系統(tǒng)深入的研究。因此，尋求新技術(shù)在腸道微生物研究領(lǐng)域的應(yīng)用成為一種必然，隨著認(rèn)識(shí)以及技術(shù)的進(jìn)步，許多輔助研究手段逐漸出現(xiàn)并被應(yīng)用，如體外厭氧發(fā)酵技術(shù)，該技術(shù)以腸道食糜或糞樣為接種物，體外模擬研究腸道微生物的代謝特性，能夠相對(duì)較好地模擬動(dòng)物體內(nèi)的實(shí)際情況。同時(shí)，體外厭氧發(fā)酵技術(shù)也可用于目標(biāo)菌株的分離篩選，接種培養(yǎng)后某些特定的菌群得到富集，目標(biāo)菌株也更容易獲得。
2.消化道微生物的分子生物學(xué)研究
鑒于傳統(tǒng)方法的局限性，科研人員逐漸開始應(yīng)用以細(xì)菌核糖體RNA序列(165rRNA)分析為基礎(chǔ)的分子技術(shù)來研究各種生態(tài)系統(tǒng)中的菌群，這其中也包括哺乳動(dòng)物的胃腸道微生態(tài)系統(tǒng)。微生物在相當(dāng)長(zhǎng)的生物進(jìn)化過程中，rRNA分子功能幾乎保持恒定，而且有些部位分子排列順序變化非常小，從這種排列順序可以檢測(cè)出種系發(fā)生關(guān)系。rRNA結(jié)構(gòu)既具有保守性，又具有高變性。保守性能夠反映出生物物種的親緣關(guān)系，為系統(tǒng)發(fā)育重建提供線索;高變性則能揭示出生物物種的特征核酸序列，是種屬鑒定的分子基礎(chǔ)。細(xì)菌rRNA有3種類型 :235rRNA、 165rRNA和 55rRNA。其中 165rRNA的相對(duì)分子質(zhì)量適中，較易于進(jìn)行序列測(cè)定的分析比較。目前165 rRNA/rDNA作為一個(gè)科學(xué)可靠的指標(biāo)廣泛用于微生物遺傳特征和分子差異研究，極大拓展了腸道微生物研究的內(nèi)容。通過對(duì)細(xì)菌分類以及對(duì)進(jìn)化標(biāo)記基因 165rRNA的測(cè)序，能夠全面深入地反映微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性，使人們對(duì)腸道微生物有了更多新的認(rèn)識(shí)。
3.消化道微生物的功能研究手段
腸道微生物的研究主要在于了解其功能，因此近年來的相關(guān)研究逐漸由過去研究腸道微生物的組成向腸道微生物的功能轉(zhuǎn)變，這也促進(jìn)了許多新技術(shù)及方法的應(yīng)用，如宏蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。利用該技術(shù)可以研究生態(tài)環(huán)境中各種微生物群落的功能，主要原理是:提取樣品總蛋白后，利用2一D(二維)電泳對(duì)總蛋白進(jìn)行分離，后分析電泳圖譜，并對(duì)圖譜中的蛋白點(diǎn)進(jìn)行鑒定并與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，確定蛋白質(zhì)信息，了解其功能。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于可以對(duì)不同樣品的圖譜進(jìn)行對(duì)比，找出差異較大的蛋白點(diǎn)，進(jìn)行序列分析，由此揭示微生物的功能。
