高蕾 浙江大學
由于傳統(tǒng)的診斷方法操作繁瑣，診斷時間長，結果重復性不好，限制了傳統(tǒng)方法在實際中的應用，但是傳統(tǒng)方法在病毒的初次分離和亞型鑒定中還起著重要的作用。隨著分子生物學的發(fā)展，應用分子生物學診斷技術進行豬流感快速診斷和鑒定已成為國內外研究豬流感的有效手段之一。分子診斷技術具有特異性好、靈敏度高、針對性強、診斷快速等優(yōu)點。
聚合酶鏈式反應( PCR) 在許多實驗室里已廣泛應用 PCR 方法來檢測流感病毒，且檢測的敏感度達到了 pg 水平。PCR 可用來鑒定分離的病毒，也可直接用于臨床病料的檢測，因此 PCR 能對疾病作出早期診斷。因其技術具有簡便、快速、靈敏、特異性強等特點，故是生物學最有價值的研究手段之一。針對 A 型流感病毒的診斷，Atlnar( 1996)建立了 RT-PCR 方法。針對流感病毒具有多種型和亞型的情況，Wright( 1995) 建立了區(qū)分型和亞型的 PCR 法。
近年來，一些基于不同靶基因的 RT-PCR 檢測方法在國外相繼建立。Ellis 等建立了檢測和鑒別不同物種 A 型流感病毒的 RT-PCR 異源雙鏈核酸分子遷移試驗( RT-PCRheteroduplex mobility assay，RT-PCR HMA) ，可早期識別動物流感和人流感的種間傳播。祈賢等針對SIV 保守基因NP 建立了套式RT-PCR，用于豬流感的檢測。Young 等( 2002)建立了多重 RT-PCR 來檢測和鑒別 H1 型和 H3 型豬流感病毒，并且與血凝試驗結果相符合，結果表明所建立的多重 RT-PCR 可用于檢測臨床樣品中不同亞型的豬流感。Jurgen等( 2004) 建立了針對 A 型豬流感病毒 Vl 基因的實時 RT-PCR，用來檢測和區(qū)別 H1 和H3 亞型豬流感。與病毒分離相比，實時 RT-PCR 的敏感性為 94%，特異性為 85%，H1，H3，N1 和 N2 特異性引物和探針檢測的敏感性低于 M 基因的檢測。
實時熒光定量 PCR 實時熒光定量 PCR 技術，是一種核酸定量技術，它是一種在PCR 反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個 PCR 進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法; 該技術不僅實現(xiàn)了對 DNA 模板的絕對定量，而且能實現(xiàn)多重反應，自動化程度高、無污染性等特點。該技術可以通過不同的解鏈溫度來區(qū)分出 H1N1 亞型流感病毒和其他 H1 亞型的流感病毒。相比普通的 RT-PCR，其更靈敏、快速( 約 50 min) 、安全和特異性高，可以實現(xiàn)對病原體的核酸的定量，但不可否認的是熒光 PCR 儀比普通的 PCR 儀要貴幾倍甚至是幾十倍，目前還不能廣泛應用于生產實踐。近幾年國外相繼有報道該法用于 SI 的診斷。2009 年 5 月，美國食品藥品監(jiān)督管理局( FDA) 和美國疾病預防控制中心( CDC) 推薦使用 AppliedBiosystems7500 Fast Dx 實時定量 PCR 儀或 7500 實時定量 PCR 儀進行甲型 H1N1 流感病毒的檢測，但該方法需要配置專門的熒光 PCR 檢測儀，檢測試劑也較貴。
依賴核酸序列的擴增法 依賴核酸序列的擴增技術也就是 NASBA 技術，是一種擴增 RNA 的新技術，反應在 42℃ 進行，擁有比 PCR 更高的擴增效率( 可以在 2 h 左右將模板 RNA 擴增約 109 倍) ，不需特殊的儀器，即使在有 DNA 污染或存在的情況下，同樣不受影響。該技術特別適用少量 RNA 分子的檢測，錯配率低，特異性強，操作簡便、靈敏度和準確率高，不受抗體的影響，適用檢測標本范圍廣泛，時間短( 6 h) 。目前，國內還沒有關于該方法應用于 SIV 檢測的報道，由于 SIV 和 AIV 同屬 A 型流感病毒，NASBA 技術在流感病毒檢測上應用前景廣闊。
核酸探針技術 核酸探針技術原理是堿基配對，互補的 2 條核酸單鏈通過退火形成雙鏈，這一過程稱為核酸雜交。核酸探針是指帶有標記物的已知序列的核酸片段，它能和與其互補的核酸序列雜交，形成雙鏈，所以可用于待測核酸樣品中特定基因序列的檢測。每一種病原都具有獨特的核酸片段，通過分離和標記這些片段就可制備出探針，用于疾病的診斷等研究。Junk 等( 2002) 用非放射性地高辛標記的 582 個堿基 cDNA 探針來檢測 A 型 H1N1 豬流感病毒編碼核蛋白的 RNA，陽性細胞呈明顯的暗黑色，證明該探針有較好的特異性和敏感性。
基因芯片技術 基因芯片是生物芯片( 包括基因芯片、蛋白芯片和芯片實驗室) 中發(fā)展最為成熟的一項技術，它是將大量已知 DNA 序列的探針通過一定方式固定于某種固相載體表面，形成致密、有序的 DNA 分子點陣; 該技術以高通量、微量化、污染少、可多基因多標本平行檢測等特點被廣泛應用于病原分型和疾病診斷等。楊林等利用該技術已成功檢測 H1N1 /H3N2 /H5N1 型 SIV，證明該方法敏感性高、特異性好。2009 年 5月，中國軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所研制出一種新型基因芯片，借助這種芯片能在5 h 內獲得檢測結果。這種基因芯片能夠用來檢測 1-16 亞型的甲型流感病毒，并且可以對當前流行的甲型 H1N1 流感病毒進行特異性檢測，還可以對 H1，H 3，H 5，H 7，H 9 亞型流感病毒進行分型檢測。
蛋白質芯片 蛋白質芯片是繼基因芯片后發(fā)展起來的生物檢測技術，其基本原理是將大量蛋白質有規(guī)則地固定在介質載體上，利用蛋白質、酶與底物、蛋白質與其他小分子之間的相互作用檢測蛋白質的一項技術。利用該技術可同時對多種蛋白質( 如流感病毒基因組 8 個基因片段共編碼的 10 種蛋白: 血凝素( HA) 、神經氨酸酶( NA) 和離子通道 M2、聚合酶蛋白 PB1，PB2、PA，PB1-F2 和核蛋白( NP) 、基質蛋白( M1) 和非結構蛋白 2 ( NS2) 、非結構蛋白 1 ( NS1) 進行檢測，使用常規(guī)方法需要上千次才能完成的任務在蛋白質芯片上僅需 1 次即可完成，目前檢測到的平衡數(shù)據誤差更小、更準確。M 檢測法 此法為近期美國食品藥物管理局認證的內源性病毒編碼酶檢測法。A 型和 B 型 流 感 病 毒 的 包 膜 表 面 存 在 M ， 可 將 含 α - 酮 糖 N- 乙 酰 神 經 氨 酸( N-acetvlneuraminicacid，Neu5Ac) 的底物水解。將新合成的 Neu5Ac 標記上色素原，形成 M 底物，當存在 A 型和 B 型流感病毒時，含有色素原的底物被病毒的 M 分解，釋放出色素原，可通過光測定裝置進行檢測。由于 M 檢測法所采用的底物只能被 A 型和 B 型流感病毒 M 分解，所以 M 檢測法只能用于 A 型和 B 型流感病毒的檢測，而不能用于 C 型流感病毒的檢測。Novola 等應用標準板 M 試劑盒對 196 份臨床標本進行檢測，并與病毒分離進行比較，結果其敏感性高達 96%，特異性為 77%，陽性符合率59%，陰性符合率為 98%。該方法簡便、快速及敏感性極高，適用于各個基層及病毒實驗室進行臨床診斷。
傳統(tǒng)的診斷方法中有些操作繁瑣、費時，結果重復性不好，特別是流感病毒的血清型多，變異株也不斷出現(xiàn)，所有這些限制了傳統(tǒng)方法在實際中的應用，但傳統(tǒng)的診斷方法在豬流感病毒的初次分離和亞型鑒定中起著重要的作用。隨著分子生物學的發(fā)展，基于分子生物學建立的方法，如聚合酶鏈式反應、實時熒光定量 PCR，NASTB 法、核酸探針技術、內源性病毒編碼酶檢測法、基因芯片技術、蛋白質芯片等，為快速準確的診斷和檢測豬流感提供了有效的方法。隨著科學技術的發(fā)展，應把傳統(tǒng)的豬流感診斷方法和現(xiàn)代的分子生物學診斷新技術有效地結合起來，不斷改進診斷方法和技術，SI 的診斷方法必將進入一個新的階段，將為控制和消除 SI 提供必要的技術保障。
