劉啟文 上海師范大學(xué)
由于豬自身感染 HEV 無明顯臨床癥狀，要判斷豬是否感染 HEV 要通過實(shí)驗(yàn)手段來檢驗(yàn)。豬 HEV 和人 HEV 在遺傳學(xué)上沒有太大差異，用于人 HEV 的診斷方法也可用于豬 HEV 的診斷。近幾年基層獸醫(yī)已經(jīng)建立了一系列特異性的診斷方法：
1 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）：
是目前用于檢測(cè)血清 HEV 抗體最常用的一種方法，具有操作簡(jiǎn)便快速，費(fèi)用低，敏感性高，特異性好的優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)的血清抗體主要是 IgG、IgM 和 IgA，是目前在實(shí)驗(yàn)室輔助診斷和流行病學(xué)調(diào)查中最常用的方法和研究熱點(diǎn)。其中以間接 ELISA 用途最廣。用于檢測(cè)HEV的抗原有三種即：組織培養(yǎng)全病毒抗原，合成肽抗原和表達(dá)抗原，目前最受關(guān)注的是表達(dá)抗原。常用的表達(dá)抗原有ORF2的表達(dá)抗原，ORF3的表達(dá)抗原以及同時(shí)含有ORF2和ORF3編碼產(chǎn)物的重組表達(dá)抗原。
2 PCR方法：
用于檢測(cè)HEV最常用的是巢式逆轉(zhuǎn)錄- PCR（巢式RT- PCR），這種方法可以較靈敏的檢出含量減少的RNA基因組。由于戊肝病毒的基因型不同，因此用于PCR的引物設(shè)計(jì)非常關(guān)鍵。用RT-PCR方法檢測(cè)時(shí)，血清陽轉(zhuǎn)前1-2 周可檢測(cè)到HEV RNA ，絕大多數(shù)樣本血清陽轉(zhuǎn)后測(cè)不出RNA，其在戊肝發(fā)病后血清和糞便中的病毒量均迅速降低，檢出窗口較短，因此對(duì)采樣時(shí)間有較高要求。已有很多學(xué)者利用染料SYBR Green和探針TaqMan來標(biāo)記ORF2 和ORF3 基因的實(shí)時(shí)定量PCR來檢測(cè)HEV RNA，而且用傳統(tǒng)的巢式RT-PCR方法檢測(cè)出來的陰性血清可以用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)出HEV 微粒。
3 PCR 產(chǎn)物限制性長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）：
首先進(jìn)行巢式 RT-PCR，其次是用一定的限制性內(nèi)切酶對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行酶切，電泳觀察片段差異，最后確定 HEV 基因型，不用進(jìn)行 PCR 產(chǎn)物的測(cè)序鑒定。
4 免疫電鏡（IEM）：
免疫電鏡法是最早用于檢測(cè) HEV感染的手段，以實(shí)驗(yàn)感染動(dòng)物的急性期、恢復(fù)期血清作已知抗體檢查待測(cè)糞便、膽汁標(biāo)本中的 HEV 顆粒，以觀察到糞便標(biāo)本中有由抗體包裹的 3 個(gè)以上病毒顆?；蚪?jīng)與抗體反應(yīng)后的病毒凝集物至少 3 個(gè)以上則判為陽性，如僅見 1 個(gè)或 2 個(gè)這樣的病毒顆粒，應(yīng)再次檢查此標(biāo)本，如仍有病毒顆?；蛏鲜龅哪锎嬖趧t判為陽性。該法的優(yōu)點(diǎn)是直視可靠，但敏感性差，且特異性抗體來源有限和需用電鏡，這就使其應(yīng)用受到了較大的限制。該法的優(yōu)點(diǎn)是直觀可靠，但敏感性差，對(duì)儀器設(shè)備和檢測(cè)人員素質(zhì)要求較高，這就使其應(yīng)用受到了較大的限制。
5 免疫熒光試驗(yàn)（IFA）：
該法用于 HEV 抗體的檢測(cè)，在HEV 感染期間，免疫熒光實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)到肝細(xì)胞組織中的 HEV 的特異性抗原。用熒光素標(biāo)記純化的抗-HEV-IgG 去檢測(cè)實(shí)驗(yàn)感染猴肝組織中的 HEV-Ag，敏感性可達(dá) 90%以上，通過免疫熒光阻斷法證實(shí)其有高度的特異性，與其他型肝炎間無交叉反應(yīng)。本法敏感性、特異性均高，但需取肝組織檢查，故其應(yīng)用也受到一定的局限。
6 免疫印跡（IB）：
常用 Western 轉(zhuǎn)印法（WB），多采用重組的表達(dá)抗原檢測(cè)血清中的 HEV IgM 和 IgG 抗體。雖然 WB 法檢測(cè)特異性高，但操作技術(shù)相對(duì)復(fù)雜，檢測(cè)所需時(shí)間較長(zhǎng)，目前未有商品的試劑供應(yīng)，因此該法更多用于 HEV 的實(shí)驗(yàn)室研究。
7 原位雜交（ISH）：
原位雜交即組織原位雜交，是在細(xì)胞保持基本形態(tài)的情況下，將探針注入細(xì)胞內(nèi)與 RNA 或 DNA 雜交。雜交反應(yīng)在載玻片或其他支持物上的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，根據(jù)所用探針的種類和要檢測(cè)核酸的不同，可分位為DNA-DNA，RNA-DNA 及 RNA-RNA 雜交。用于原位雜交的探針可以是單鏈或雙鏈 DNA 或 RNA，探針的標(biāo)記物可以是放射性的也可以是非放射性的。ISH 敏感性高，可以精確定位 HEV 病毒或其 RNA 在細(xì)胞中的部位，為進(jìn)一步深入研究其致病機(jī)理提供幫助。
Choi 等用非放射性地高辛標(biāo)記的 289bP 的 cDNA 探針，對(duì)石蠟包埋的組織切片進(jìn)行原位雜交，結(jié)果肝細(xì)胞和膽囊切面內(nèi)出現(xiàn)很強(qiáng)的信號(hào)，同時(shí)陽性信號(hào)也出現(xiàn)在小腸，大腸，淋巴結(jié)，扁桃體，脾臟和腎臟，用 PCR 法進(jìn)行驗(yàn)證，符合率 100%，其中，肝臟中陽性率最高，其次是大腸、小腸、膽汁、脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體和腎，原位雜交檢測(cè)陽性鏈的 HEV-RNA 并為細(xì)胞定位和組織學(xué)構(gòu)架提供詳細(xì)資料。
8 異源雙鏈核酸分子電泳遷移測(cè)定法（MHA）：
該法能在不測(cè)序的條件下，快速鑒定出基因序列密切相關(guān)的不同分離株之間的相似程度。其原理是當(dāng)分離株和參考株的 DNA 分子混合，進(jìn)行退火變性，然后復(fù)性，在復(fù)性時(shí)，兩個(gè)密切相關(guān)的單鏈 DNA 分子就會(huì)形成異源雙鏈核酸分子，異源雙鏈核酸分子中錯(cuò)配或不配對(duì)的堿基造成結(jié)構(gòu)的變形，使其在 PAGE 電泳中遷移速度變慢，遷移率下降的程度反映了分離株與參考株之間的變異程度。
Sun 等用豬分離株做參考株，分別和 22 個(gè)豬 HEV 分離株進(jìn)行混合，用簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增 ORF2 區(qū)，用同樣的方法擴(kuò)增 13 個(gè)禽 HEV 分離株與禽 HEV 參考株的 ORF1 區(qū)，用 8%的 PAGE 分離 PCR 產(chǎn)物中的同源和異源雙鏈核酸分子，根據(jù)電泳圖譜確定各分離株和參考株之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過 HMA 圖譜得出的分離株的關(guān)系與核昔酸序列同源性計(jì)算和進(jìn)行樹繪制得到的結(jié)果很吻合。
9 樹狀 DNA 雜交技術(shù)（DDH）：
DDH 是一種基于核酸雜交的信號(hào)放大技術(shù)，通過增加標(biāo)記探針的拷貝數(shù)或標(biāo)記物的信號(hào)強(qiáng)度來提高敏感性。趙秀麗等利用 DDH 對(duì) 25 份 RT-nPCR 檢測(cè) HEV 陽性標(biāo)本的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的檢測(cè)均顯陽性。單祥年等對(duì) HEV 5 個(gè)不同基因型和亞型逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 DDH 檢測(cè)也呈陽性，證明樹狀 DNA 雜交技術(shù)檢測(cè) HEV 病毒有較好的敏感性和通用性。但 DDH 技術(shù)作為一種新的檢測(cè)技術(shù)也有固有的缺陷，例如實(shí)驗(yàn)中核酸固定、預(yù)雜交和雜交都需要比較長(zhǎng)的時(shí)間，實(shí)驗(yàn)步驟比較繁瑣，參數(shù)不易控制，且難以用于直接雜交檢測(cè)等，這些都是 DDH 技術(shù)推廣應(yīng)用所必須解決的問題。
10免疫色譜技術(shù)：
2005 年 Chen 等報(bào)道了一種在血清中快速檢測(cè) HEV IgM的免疫色譜技術(shù)。這個(gè)技術(shù)利用了 HEV ORF2 端區(qū)域（氨基酸 394-660）重組蛋白 EP211 和單克隆抗體 4B2，基于一種新的逆流技術(shù)，可以在 2-3min 內(nèi)得出結(jié)果，這項(xiàng)技術(shù)可以應(yīng)用到現(xiàn)場(chǎng)和緊急情況以及資源缺乏的國(guó)家。
