余騰 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
(l)PET-28b一CZI巧表達載體的構(gòu)建
使用細菌基因組小提試劑盒提取 T+PmHN一13的基因組，制備PCR的模板，PCR擴增的引物參照表3一 l(PC一1，PC一2)。PCR反應(yīng)體系為50林L，體系中各組分別為:lox幾 qBu價5.0林L， dNTPS2.0林L，上下游引物各1.0件L，ExTaq酶0.5林L，模板2.0林L，滅菌單蒸水加至總體積so.ouL。PeR反應(yīng)條件是 :94OCsmin;94oC455， 59OC455，72℃3min，30個循環(huán);72oC延伸10min;降溫至4OC。擴增目的片段大小為2115bp，上下游分別引入BamHI和Saz鹿切位點。
將PCR擴增的目的片一段經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，驗證為目的片段后，經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳和DNA回收試劑盒進行回收，回收產(chǎn)物取1抖L進行電泳，驗證其是否為回收產(chǎn)物以及初步估計回收產(chǎn)物的濃度，隨后將回收產(chǎn)物經(jīng)Ban仔刀和Sall進行雙酶切，并經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳和DNA回收試劑盒進行回收，得到回收產(chǎn)物I;同時將質(zhì)粒PET-28b經(jīng)Ba。刀了和Sall進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng) 1.0%的瓊脂糖凝膠電泳和DNA回收試劑盒進行回收，得到回收產(chǎn)物n。將產(chǎn)物I和產(chǎn)物n各取1拼L進行電泳，初步估計兩種回收產(chǎn)物濃度的大致比例，按照一定的質(zhì)粒和載體量加入到滅菌的EP管中，在T4連接酶的作用下，4℃過夜連接。
(2)感受態(tài)細胞的制備和轉(zhuǎn)化
感受態(tài)細胞選用大腸桿菌DHS。或BLZ，(DE3)，制備方法通過氯化鈣法制備感受態(tài)細胞，感受態(tài)制備的具體操作過程參照《分子克隆實驗指南》(第三版)中的方法進行。
連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:取裝感受態(tài)細胞(DHS?；駼L21)的EP管放置于冰上，將4℃過夜的連接產(chǎn)物加入到盛裝有感受態(tài)細胞的EP管中并混勻，接著將EP管在冰上放置 30min，然后將其放入42OC水浴中，熱擊905，再放回冰上Iomin，向熱擊后的EP管中再加入400件LLB液體培養(yǎng)基，在37℃20Or/m的搖床中培養(yǎng)45min，取出EP管，8000r/m離心smin，棄部分上清，留約100拼L上清與菌液混勻，并將其均勻涂布于含25件g/mL卡那霉素(KZ:)抗性TSA平皿，37OC培養(yǎng)至有單菌落出現(xiàn)(24h后還無單菌落出現(xiàn)時，則需重新連接連接雙酶切產(chǎn)物，并重新進行轉(zhuǎn)化)。轉(zhuǎn)化子的驗證:挑取在KZ:抗性TSA平皿上生長出單菌落，在加有KZ:的TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，提取質(zhì)粒，分別進行BamHI和Sall雙酶切和PCR，驗證重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。此重組質(zhì)粒命名為PET-28b一C21巧，重組蛋白命名為PM工 CZ115。
(3)重組蛋白的表達和純化
將構(gòu)建成的PET-28b一C21巧重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞BLZ，，挑起陽性轉(zhuǎn)化子進行誘導(dǎo)表達。其表達過程如下:挑起陽性轉(zhuǎn)化子，加入到含有K25的TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8h，放入4℃冰箱過夜。第二天將50林L含轉(zhuǎn)化子和空質(zhì)粒菌液分別加入到含有K25的 smLTSB液體兩瓶培養(yǎng)基中，在37℃條件下振蕩培養(yǎng)約3h，至OD6DO達到0.6一1.0時，加入5件 L1.omol幾異丙基硫代一p一D一半乳糖普(IPTG)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，每隔lh(第l、2、3、4h)取O.smL菌液分別收集于Ep管中。將8管收集的細菌， 8000r/min離心 5min，棄上清，先加入50件L滅菌單蒸水混勻，再加入50林LZxsDS上樣緩沖液，混勻后沸水煮沸10min，于12%的SDS一PAGE檢測重組蛋白的表達情況。SDS一PAGE膠的下層膠上層膠的配制，參照《分子克隆實驗指南》(第三版)中的配方進行。表達蛋白的可溶性判定:取誘導(dǎo)表達4h后的細菌培養(yǎng)物50mL，通過 8000r/m離心 10min，收集菌體，加2.smL的PBs重懸，超聲波破碎巧min(冰上操作)，然后在4’C條件下， 12000r/m離心巧min，分別收集上清和沉淀。沉淀加入2.smL的PBS重懸，分別取50林L上清和50林L沉淀，并分別加入50卜LZ‘SDS上樣緩沖液，混勻后及作為SDS一隊GE電泳樣品。
對于37℃條件下誘導(dǎo)產(chǎn)物大部分在包涵體中的情況，嘗試采用低溫低IPTG長時間誘導(dǎo)的方法，使誘導(dǎo)產(chǎn)物在分泌在細菌細胞內(nèi)。其具體操作方法同前方法類似，只是菌液誘導(dǎo)溫度和IPTG終濃度有所不同，低溫誘導(dǎo)采用的是 0.1~o1/LIPTG28℃誘導(dǎo)10h和 0.01~ol/LIPTG20℃誘導(dǎo)ZOh。接著按照前面介紹方面制備上樣液，于12%的SDS一PAGE檢測重組蛋白的表達情況，并分別檢驗表達蛋白的在上清和沉淀中的含量。
重組蛋白的純化:(1)按照Ni2+離子交換柱說明書的介紹，將填料進行上柱，固定柱子后靜置10min，待填料和上清液面出現(xiàn)清晰的分界線后，將一與交換柱內(nèi)徑相當大小的濾紙片輕輕蓋在分界處。(2)打開交換柱的出口，將柱中液體放出，當上清液面即將降至濾紙片時，加入結(jié)合緩沖液(體積為填料總體積的3倍，約25mL)進行清洗填料。(3)待洗滌液液面接近濾紙片時，加入可溶性重組蛋白，加入體積不超過填料總體積的2倍，約10mL。此時應(yīng)降低交換柱出口液體的流速，使帶組氨酸標簽可溶性重組蛋白與Ni2+離子填料充分接觸鰲合。(4)待液體液面接近濾紙片時，再加入結(jié)合緩沖液進行清洗，結(jié)合緩沖液體積約是填料體積的5倍(約25mL)。(5)待洗滌脫液面接近濾紙片時，加入結(jié)合緩沖液，其體積約為填料體積的2倍(約IOmL)，同時將潔凈的EP管放置交換柱出口處，開始盛接洗脫下來的液體，每管盛裝lmL左右，盛接洗脫液共計10管左右。待洗脫液降至濾紙片時，加入5倍填料體積的結(jié)合緩沖液，同時停止盛接洗脫液。(6)待結(jié)合緩沖液液面接近濾紙片時，加入10mL20%乙醇。待5mL20%乙醇流出后，關(guān)閉交換柱出口，并放4℃條件下保存(注意保存時要保持填料在20%乙醇中浸泡)。在盛裝洗脫液的EP管中各取10協(xié)L，分別加入10拼 LZxSDS上樣緩沖液，混勻后及作為sDs一PAGE電泳樣品，進行SDS一PAGE，分析其純度。將純度很高的蛋白質(zhì)通過TE透析3天，測定蛋白質(zhì)的含量。
(4)表達產(chǎn)物的 westernblot檢測
將純化后的重組蛋白分別進行SDS一PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜Zh后進行洗滌顯色。具體操作過程參照湯細彪博士論文中的方法進行。
(5)重組蛋白的方陣滴定試驗
將純化后并已經(jīng)測定出蛋白含量的重組蛋白 PMT-CZ115，按1:100、1:200倍比稀釋到1:12800，分別加入到酶聯(lián)板1至8行，每行包被蛋白濃度相同，每孔加入重組蛋白和包被液總體積100林L。將其于37℃溫箱中溫育lh，然后放置于4OC冰箱中過夜;次日取出酶聯(lián)板用洗滌液洗3次，每次間隔3一smin;然后每孔加入120件L封閉液，37oC封閉3Omin;將陽性血清按l:10、l:20倍比稀釋至1:320，加入到酶聯(lián)板的第l至第6列，每列陽性血清稀釋倍數(shù)相同;陰性血清也按1:10、1:20倍比稀釋至1:犯0，加入到酶聯(lián)板的第7至第12列，每列陽性血清稀釋倍數(shù)相同，酶聯(lián)板每孔血清總體積為100林L;在37℃溫箱中溫育 30min后，用洗滌液洗3次，每次間隔3一smin;加入羊抗豬二抗100協(xié)L/孔(科前公司生產(chǎn)稀釋后的酶標二抗)，37℃反應(yīng)30min，通過洗滌液洗滌5次后加入底物液A和B各50林L，反應(yīng) 10min后，加入50卜L終止液C終止反應(yīng)，用酶標儀在630nm波長下測定OD值。
結(jié)果的判斷標準:在相同的抗原包被濃度情況下，相同比例稀釋度的陽陰性血清對應(yīng)的OD630值之比(P/N)值最大時，其對應(yīng)的抗原包被濃度和血清稀釋度分別為最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋度。
(6)ELIsA陰陽界限值的確定
采集不含有產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌或PMT毒素的疫苗免疫，以及無萎縮性鼻炎臨床癥狀的豬萎縮性鼻炎陰性血清190份，分別進行間接ELISA檢測。設(shè)置標準陰、陰陽性對照。計算待檢陰性血清的平均值(x)和待檢陰性血清的標準偏差(SD)。求得陰陽界限值為X+ZSD值。
(7)ELISA操作方法的優(yōu)化
主要是對封閉液的選擇和封閉時間，待檢血清的溫育時間，二抗溫育時間分別進行優(yōu)化。封閉液選擇含0.5%，1.0%，1.5%BSA和2.5%，5.0%，7.5%脫脂乳，封閉時J司選擇30，45，60min幾個梯度進行優(yōu)化;待檢血清溫育時}‘司設(shè)置15，30，45，60min等四個時間梯度進行優(yōu)化;二抗溫育時間也設(shè)置15，30，45，60min等四個時間梯度進行優(yōu)化。
(8)ELISA檢測方法的特異性
使用所建立的間接ELISA方法分別檢測致豬水腫病大腸桿菌、豬沙門氏菌、副豬嗜血桿菌、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、Bb、T一Pm等細菌病原的陽性血清，以及豬圓環(huán)病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸道綜合癥病毒、豬口蹄疫等病毒病原的陽性血清，同時設(shè)立陰、陽性對照，觀察上述各血清與產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌陽性血清的交叉反應(yīng)情況。
(9)ELISA檢測方法的敏感性
用甲醛滅活的PMT粗提物免疫5頭PMT抗體陰性的健康豬，分別于免疫后7d、 14d和29d采血分離血清，對各時間段的血清進行ELISA檢測，確定其敏感性。
(10)ELISA檢測方法的批內(nèi)和批間重復(fù)性
批內(nèi)重復(fù)性試驗:隨機取3塊同一批包被重組蛋白的酶聯(lián)板，檢測8份己知背景的豬血清，陰、陽性血清各4份，通過優(yōu)化的間接ELISA方法，檢測同一份血清在不同孔中oD值，驗證同一批包被酶聯(lián)板之間的穩(wěn)定性，并計算變異系數(shù)CV(標準差與平均值之比)。
批間重復(fù)性試驗:隨機抽取3塊不同批次包被重組蛋白的酶聯(lián)板，檢測8份已知背景的豬血清，陰、陽性血清各4份，通過間接ELISA方法，檢測同一份血清在不同批次酶聯(lián)板孔中OD值，驗證不同批包被酶聯(lián)板之間的穩(wěn)定性，并計算變異系數(shù)CV。
(11)保質(zhì)期試驗
將重組蛋白按照確定的最佳包被濃度，一次包被10塊酶聯(lián)板，將其放入4℃冰箱中保存，分別于0個月、1個月、2個月、3個月、6個月、9個月分別取出一塊，通過間接ELIsA方法進行檢測，每次檢測相同的8份血清(血清開始就進行分裝，并放入一80℃冰箱中凍存)，觀察血清的OD630值變化情況，確定其保質(zhì)期。
