吳志強(qiáng) 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
畜牧哺乳動物體細(xì)胞克隆技術(shù)經(jīng)過十年的發(fā)展與完善，其操作越來越簡單，成本逐漸減低，效率也逐漸提高。但動物克隆是一個(gè)系統(tǒng)工程，包括供體細(xì)胞的準(zhǔn)備、卵母細(xì)胞的成熟、卵母細(xì)胞的去核與注核、重構(gòu)胚的融合與激活、重構(gòu)胚的體外培養(yǎng)、胚胎移植和妊娠維持等很多的技術(shù)環(huán)節(jié)，影響因素較多。結(jié)合每個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)，分析一下豬體細(xì)胞克隆技術(shù)中潛在的影響因素。
1供體細(xì)胞的選擇
在體細(xì)胞克隆中，供體細(xì)胞幾乎提供了全部的遺傳物質(zhì)，它決定了克隆后代的遺傳性狀。供體細(xì)胞的準(zhǔn)備是體細(xì)胞克隆技術(shù)最為重要的環(huán)節(jié)之一，獲得大量的同源供體細(xì)胞是提高克隆效率的途徑之一。雖然構(gòu)成哺乳動物機(jī)體的細(xì)胞類型有200多種，但是能夠用來作為供體細(xì)胞克隆出后代的細(xì)胞類型只占很小的比例，不到5%。在豬上，體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞大多選用胎兒成纖維細(xì)胞，研究人員認(rèn)為來源于胎兒或新生動物的體細(xì)胞往往具有較高的克隆效率，原因可能是這些細(xì)胞分化程度較低，比較容易被正確的重編程。雖然建立胚胎干細(xì)胞系可以提供核移植供體細(xì)胞，然而在豬上還沒有獲得和建立胚胎干細(xì)胞系，因此以胚胎干細(xì)胞作為核移植供體細(xì)胞還不能實(shí)現(xiàn)。
此外，供體細(xì)胞與受體細(xì)胞的周期協(xié)調(diào)對于核移植的成功也很重要?！癉ofly”羊的成功主要是對供體細(xì)胞經(jīng)行了血清饑餓，使其進(jìn)入GO期。此后很多研究者也紛紛采用血清饑餓的方法處理供體細(xì)胞，并獲得了不錯(cuò)的效果。但實(shí)驗(yàn)證明GO期供體細(xì)胞并非克隆成功必需，Dyce等用GZ/M期的細(xì)胞進(jìn)行核移植并成功獲得了克隆動物。
2受體卵母細(xì)胞的培養(yǎng)
豬體細(xì)胞克隆中，最常用的受體是Mn期卵母細(xì)胞。由于在豬的體細(xì)胞克隆中需要的卵數(shù)量較大，同時(shí)從經(jīng)濟(jì)的角度出發(fā)，一般從屠宰場獲取大量卵巢，從卵泡中抽取并挑選好的卵丘一卵母細(xì)胞復(fù)合體，在體外成熟培養(yǎng)至MH期，而超排取卵一般不適合豬體細(xì)胞克隆。卵母細(xì)胞的體外成熟包括細(xì)胞核的成熟和細(xì)胞質(zhì)的成熟兩個(gè)相互聯(lián)系的過程，通常細(xì)胞核成熟之后其細(xì)胞質(zhì)還沒有完全成熟，而細(xì)胞質(zhì)的成熟對于胚胎的發(fā)育至關(guān)重要。影響卵母細(xì)胞體外成熟的因素很多，其中體外成熟培養(yǎng)液的組成成分是至關(guān)重要的因素。在組成成分中，胎牛血清(FBS)和卵泡液(PFF)是最常用的兩種添加成分，由于其成分復(fù)雜、并且具有多種生物活性因子，因此在多種動物的卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)中都能夠起到很好的促成熟效果。我們實(shí)驗(yàn)室的豬卵母細(xì)胞體外成熟液以改良型的TCM199作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，并添加了胎牛血清、豬卵泡液、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、孕馬血清促性腺激素 (PMSG)、表皮成長因子(EGF)等成分，得到了比較好的卵母細(xì)胞體外成熟效果。
此外，選擇以合適卵齡的成熟卵母細(xì)胞作為受體對核移植的成功也很重要。目前常用的卵母細(xì)胞主要是成熟培養(yǎng)40一46h左右的卵母細(xì)胞。
3重構(gòu)胚的構(gòu)建
體細(xì)胞核移植操作首先要去除成熟卵母細(xì)胞的細(xì)胞核，以接受外源的體細(xì)胞核。而卵母細(xì)胞的去核程度與重構(gòu)胚的后續(xù)發(fā)育能力密切相關(guān)，去核率越高，去除的胞質(zhì)越少，重構(gòu)胚發(fā)育到期的概率就越大。在去核之前，通常要對成熟的卵母細(xì)胞用一定濃度的細(xì)胞松弛素B(CytochalasinB，cB)處理一段時(shí)間，以減小去核時(shí)對卵母細(xì)胞的物理損傷。目前已經(jīng)發(fā)展了多種卵母細(xì)胞的去核方法，主要有 Hoechst33342示核法、盲吸法、化學(xué)試劑去核法、離心去核法、半卵法、末期去核法、擠壓法、蔗糖處理去核法、微分干涉和極性顯微鏡去核法等等。但這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，如示核法或化學(xué)試劑處理會對卵母細(xì)胞造成損傷，盲吸法的去核率較低等。我們實(shí)驗(yàn)室使用的是帶有Spindie一View紡錘體觀察系統(tǒng)的顯微操作去核。
去核后的卵母細(xì)胞可作為核移植的受體接受核供體移入。用顯微注射針吸取合適的供體細(xì)胞，并將其注射到去核的卵母細(xì)胞中或者卵周隙內(nèi)。實(shí)驗(yàn)室一般采用卵周隙注射。
4重構(gòu)胚的激活
在將供體細(xì)胞注入到去核卵母細(xì)胞的卵周隙之后，并沒有形成完整意義上的重構(gòu)胚胎，還需要將供體細(xì)胞的細(xì)胞核導(dǎo)入到卵母細(xì)胞質(zhì)中，這個(gè)過程稱之為融合。常用的融合方法有滅活的仙臺病毒介導(dǎo)的融合和電融合，其中電融合已經(jīng)成為普遍采用的融合方法。具體操作為:調(diào)整卵母細(xì)胞位置使卵母細(xì)胞與供體細(xì)胞的接觸面與電場方向垂直，然后施加瞬間高強(qiáng)度的直流脈沖，擊穿細(xì)胞膜，使其通透性發(fā)生改變，促使緊密接觸的兩細(xì)胞膜發(fā)生融合。同時(shí)由于電擊在細(xì)胞膜上產(chǎn)生的小孔可以引起c擴(kuò)十的內(nèi)流，類似于精子入卵時(shí)的Ca2+濃度升高的過程。當(dāng)電脈沖過后，質(zhì)膜迅速恢復(fù)。在融合液中ca2+存在的情況下，可以引起卵母細(xì)胞的激活。
豬體細(xì)胞克隆中，對重構(gòu)胚電融合及激活處理之后，一般還對其進(jìn)行化學(xué)激活來啟動胚胎發(fā)育。且常在重構(gòu)胚胎體外培養(yǎng)液中添加CB來處理重構(gòu)胚3一4h，以防止第二極體排出，維持正常的二倍體核型，這樣的效果比較理想。
5重構(gòu)胚的體外培養(yǎng)和移植
激活后的重構(gòu)胚胎一般要在體外培養(yǎng)一段時(shí)間再進(jìn)行胚胎移植。從融合胚到囊胚階段的胚胎都可適時(shí)移入代孕受體。由于體外培養(yǎng)體系存在的缺陷，也會導(dǎo)致重構(gòu)胚胎停滯，死亡，流產(chǎn)，死胎或出生后死亡和患有巨胎癥 (LargeoffsPringSyndrome，LOS)等異常。
豬體細(xì)胞克隆胚胎體外培養(yǎng)中，最常用的體外培養(yǎng)液是NCSU一23，此外還有人研制了PzM一3等新的培養(yǎng)基。如何使胚胎通過發(fā)育阻滯階段，一直是近些年胚胎體外培養(yǎng)的研究熱點(diǎn)。最初，人們采用降低氣相環(huán)境中的氧濃度，采用混合氣(90%NZ，5%C02，5%o:)來促使胚胎通過發(fā)育阻斷，并取得了一定的效果，但是效果并不穩(wěn)定。有研究發(fā)現(xiàn)，與體細(xì)胞共培養(yǎng)是促使胚胎通過發(fā)育阻斷的最為有效的途徑，并由此導(dǎo)致胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)的迅速發(fā)展。目前用于胚胎共同培養(yǎng)的體細(xì)胞主要有輸卵管上皮細(xì)胞、滋養(yǎng)層細(xì)胞、卵丘細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、黃體細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞等。體細(xì)胞對胚胎的有利效應(yīng)，可能是通過分泌生長促進(jìn)因子、去除培養(yǎng)液中有毒化合物(如重金屬雙價(jià)離子)或降低培養(yǎng)液中02的分壓實(shí)現(xiàn)的。
豬克隆胚胎移植過程中，保持代孕母體子宮的生理階段與克隆胚胎的同步是移植成功與否的關(guān)鍵因素。有資料報(bào)道，“老胚胎”和“年輕子宮”的兼容性要比“年輕胚胎”與“老子宮”之間的兼容性好。豬克隆胚胎移植多是在1細(xì)胞，2一4細(xì)胞或4一8細(xì)胞階段采用輸卵管內(nèi)移植，總數(shù)一般不低于120枚，且優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)不能少于4枚，這對于豬的妊娠識別和妊娠維持至關(guān)重要。
