張翼 中國科學技術大學
基因打靶技術在現(xiàn)如今已在畜牧養(yǎng)殖領域中得到廣泛的應用，成功分離的完善的胚胎干細胞系和胚胎重建技術是該技術在小鼠上得以快速發(fā)展的重要基礎。但是大多數(shù)的動物，尤其是大動物，例如豬，細胞在培養(yǎng)的過程中會逐漸地喪失其全能性，不能將遺傳修飾傳遞給后代，這是建立豬穩(wěn)定的胚胎干細胞系的重大障礙。在過去的五年中，構建了超過 14,000 為敲除小鼠上的基因的載體，而在豬上敲除的基因還不到 10 個。
1996 年利用胚胎成纖維細胞克隆成功獲得綿羊,隨后，Dolly 羊也成功誕生，說明已分化的細胞經(jīng)過一次靜息期可獲得重編程的能力，這為在大動物上進行基因打靶提供了一個新的方向，即通過轉基因克隆技術實現(xiàn)基因打靶。將基因敲除和體細胞克隆技術相結合可以彌補大動物中沒有胚胎干細胞系的障礙，進行各種基因修飾。
2000 年世界上首次通過體細胞核移植成功誕生基因敲除的綿羊，之后的 2002 年，賴良學等用體細胞核移植的方法敲除了豬的α-1,3-半乳糖苷酶基因。他們在 GGTA1 位點上構建了一個長為 21kb 的置換型打靶載體，G418 篩選豬胎兒成纖維細胞 14 天后，用 2對引物檢測 17 個克隆，其中有 8 個細胞克隆發(fā)生了同源重組。共移植 338 枚胚胎，得到 7 頭小豬，3 頭死亡，其余四頭活力正常。這項成果使異種器官移植邁出了關鍵的第一步，同時也讓科學家們看到在大動物上實現(xiàn)基因打靶的希望和曙光。
除了使用豬胎兒成纖維細胞作為轉染的受體，人們也在尋找其他的細胞希望能夠盡可能和胚胎干細胞相似。2011 年的 7 月份，報道了在豬的胎兒肝臟衍生細胞中進行基因打靶和克隆的研究。研究者發(fā)現(xiàn)胎兒肝臟衍生細胞可以分裂 80 代以上，依然保持正常的核型。
基因打靶和雜合性缺失突變產(chǎn)生純合的 α-1,3-半乳糖苷酶的打靶細胞克隆。將這些陽性的胎兒肝臟衍生細胞克隆用于體細胞核移植能產(chǎn)生純合的 α-1,3-半乳糖苷酶打靶豬。近年來鋅指核酸酶（ZFNs）和體細胞核移植結合也運用到了豬的基因打靶中。鋅指核酸酶是是人工改造的限制酶，通過融合鋅指結構的結合 DNA 結構域和分解 DNA 結構域而成?？赏ㄟ^基因工程改造鋅指結構域使鋅指核酸酶針對復雜基因組里的特定 DNA 順序。借助內(nèi)源 DNA 的修復機制，鋅指核酸酶可以精確改變高等動物的基因組。
人工構建的具有特異性的鋅指核酸酶由兩部分組成:一部分為可以特異性結合到 DNA 上的鋅指蛋白,另一部分來自于限制性內(nèi)切酶Fok I 的一個亞基,它能夠非特異性地切割 DNA 雙鏈,產(chǎn)生一個 DNA 雙鏈切口。人工鋅指核酸酶的鋅指蛋白結構域一般含有 3 個鋅指結構,每個鋅指可特異識別并結合 DNA 鏈上的 3 個連續(xù)堿基。
所以 ZFN 與 DNA 的結合是高度特異的。2010 年，Jeffery 等運用鋅指核酸酶和體細胞核移植相結合的方法，將轉入豬體內(nèi)的綠色熒光蛋白基因敲除，產(chǎn)生了外源基因打靶豬。2011 年，世界首例利用鋅指核酸酶技術培育的內(nèi)源性基因敲除豬誕生。
噻唑烷二酮類藥物（例如文迪雅）是胰島素增敏劑，用于治療 2 型糖尿病，2006 年曾經(jīng)是臨床上銷售額最大的治療糖尿病的藥物。PPARγ 是噻唑烷二酮類藥物的靶點?？茖W家們利用小鼠的研究結果表明，噻唑烷二酮類藥物在治療糖尿病的同時對心血管系統(tǒng)也有保護作用，但由于小鼠心血管系統(tǒng)與人類相差甚遠，使得小鼠的研究結果與近年臨床上觀察到的病人心臟毒副作用不一致。
因此，科學家們急需建立與人類更為接近的大動物模型來研究糖尿病及其心血管并發(fā)癥。由于豬的心血管系統(tǒng)與人類接近，是理想的研究糖尿病和心血管疾病的動物模型。此次研究中，研究者將鋅指核酸酶技術應用于豬體細胞的基因敲除，使體細胞基因敲除的效率由原來的10的-6次方提高到大于 4%，并結合克隆技術成功獲得了 2 頭 PPARγ 基因敲除豬，首次實現(xiàn)了該技術在大動物內(nèi)源性基因敲除中的應用。同年的 9 月份，又報道運用此技術高效產(chǎn)生了 α-1,3-半乳糖苷酶（GGTA1）基因的雙等位基因敲除豬。研究者針對編碼 GGTA1 催化中心設計含有特異區(qū)域的鋅指核酸酶，并用來處理豬胎兒的成纖維細胞，產(chǎn)生約 1%的雙等位基因敲除細胞，體細胞核移植后，6 個胎兒全部缺失半乳糖的抗原表位。
基因敲除豬的應用主要用于建立疾病的轉基因動物模型，改造動物基因型，發(fā)現(xiàn)和研究基因，研究發(fā)育生物學，治療遺傳病，免疫學方面的器官移植和人源化抗體的制備。本實驗為了進行 Tiki1 基因的功能缺失研究，采用傳統(tǒng)的置換型打靶載體以期敲除豬的 Tiki1 基因。
