熊煒 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
豬支原體肺炎（MPS）又稱地方流行性肺炎(EP)，是一種慢性呼吸道疾病，其原發(fā)病原是豬肺炎支原體(MHYO)。其它呼吸道病原，如豬鼻支原體、豬胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、豬源支氣管敗血波氏桿菌、多殺巴氏桿菌等也經(jīng)常繼發(fā)感染。EP是一種廣泛發(fā)現(xiàn)于世界各國畜牧業(yè)的豬呼吸道疾病，其特點(diǎn)是發(fā)病率高，死亡率低。
感染MHYO的臨床癥狀主要為慢性無痰性干咳，也可能表現(xiàn)為亞臨床過程;若發(fā)生繼發(fā)感染，臨床癥狀包括發(fā)熱和呼吸困難，病豬可能出現(xiàn)死亡。此外，MHYO與豬呼吸道綜合征的發(fā)生密切相關(guān)，這是一種既有細(xì)菌又有病毒參與的疾病，感染14-20周齡的肥育豬，臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)燒、呼吸困難、咳嗽和食欲減退，從而使飼料轉(zhuǎn)化率降低，生長速度減慢。
通過抗菌藥物和疫苗的使用，管理方法的改進(jìn)已在很大程度上減輕EP對豬群健康產(chǎn)生的不利影響，但是，在全球的養(yǎng)豬業(yè)中，由該病造成的經(jīng)濟(jì)損失仍然非常嚴(yán)重，飼料轉(zhuǎn)化率降低、平均日增重減少和治療成本的增加是導(dǎo)致這些損失的主要原因。
1.病原的基本特性
MHYO是支原體科支原體屬的成員，因其沒有細(xì)胞壁，形態(tài)具有多樣性，大小不等，在肺觸片和液體培養(yǎng)物中常呈球狀，直徑約0.2-0.5μm，偶有長鏈狀、絲狀和新月狀。它僅有3種細(xì)胞器，即細(xì)胞膜、核糖體和原核細(xì)胞核。細(xì)胞膜厚度約為8-11nm，由3層單位膜所構(gòu)成。MHYO營養(yǎng)要求高，需要從體外攝取多種能通過細(xì)胞膜營養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸、脂肪酸、膽固醇和維生素。
2.病原的分子生物學(xué)
和其它支原體一樣，MHYO是最小的、最簡單的半保留復(fù)制的原核微生物，其沒有染色體，只具有染色質(zhì)，即核質(zhì)。其基因組比細(xì)菌少幾百萬個(gè)堿基，缺少或缺失很多基因，如有關(guān)核酸前體、維生素和脂肪酸合成的基因。chris等測定了 MHYO232的基因組，其大小為892，758bP，蛋白編碼基因共有692個(gè)。該研究發(fā)現(xiàn)，MHYO基因組中的G+c含量較低，為28.6%，這可能使其失去一些通用密碼。在一般的生物中為終止密碼的TGA，在MHYo中則為色氨酸的密碼子。
3.病原的免疫原性
由于MHYO缺乏細(xì)胞壁，其主要抗原存在于莢膜和細(xì)胞膜。莢膜中含有的多種勃附蛋白和豁附相關(guān)蛋白，細(xì)胞膜上的含有多種膜蛋白，這些蛋白是產(chǎn)生免疫反應(yīng)的主要抗原。研究者已對多種抗原蛋白進(jìn)行了深入研究，并且不斷發(fā)現(xiàn)新的蛋白抗原。P97蛋白，這是一種纖毛結(jié)合蛋白。研究發(fā)現(xiàn)P97C末端附近有Rl和R2兩個(gè)重復(fù)區(qū)。張敬啟等研究發(fā)現(xiàn)，單克隆抗體具有抑制MHYO結(jié)合豬氣管纖毛的能力。用免疫印跡試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與該單克隆抗體反應(yīng)的是一種分子量為97ku的蛋白質(zhì)。P97蛋白隨機(jī)分布于MHYO的表面。在感染MHYO后，最早產(chǎn)生的抗體是針對P97的IgM和IgA。Hsu等對P97的粘附作用部位和抗原識別表位進(jìn)行了初步定位，發(fā)現(xiàn)P97的Rl區(qū)域能夠發(fā)揮獨(dú)立的粘附功能。MinionF，c等研究發(fā)現(xiàn)，P97蛋白Rl區(qū)含有25個(gè)連續(xù)saa重復(fù)基元，單克隆抗體能識別其中的三個(gè)。
至此，P97粘附作用的部位與單克隆抗體的識別表位在分子水平上被闡明。此外，研究發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)疫苗相比，用Rl亞基重組疫苗免疫后，小鼠和豬能產(chǎn)生更高水平的IgG。P46蛋白，它是種特異性的膜蛋白，F(xiàn)uto等將P46基因克隆到載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行原核表達(dá)后，純化重組蛋白，將該蛋白應(yīng)用于檢測MHYO抗體的ELIsA，可以消除與豬其它支原體之間的交叉反應(yīng)。覃青松等研究表明P46蛋白也是一種抗原蛋白。通過重疊延伸PcR，遲靈芝等定點(diǎn)突變了P46基因的三個(gè)位點(diǎn)，之后克隆到表達(dá)載體pET-32(+)中，用PTG進(jìn)行誘導(dǎo)后，在 E.coliRosetta(DE3)宿主菌表達(dá)成功。研究表明，該融合蛋白免疫原性較好。
P65蛋白和P42蛋白，P65蛋白是一種攜帶有種特異性抗原決定簇的膜蛋白，其特性與脂酶類似。P42蛋白，這是一種由1655個(gè)核普酸編碼的熱休克蛋白質(zhì)。Kim等鑒定出P65蛋白，經(jīng)單克隆抗體和多克隆抗體證實(shí)，P65是MHYO的一個(gè)主要抗原，其免疫原結(jié)構(gòu)域置于細(xì)胞膜外側(cè)。將基斷口尸裕基因克隆到載體上，并用E.。oli進(jìn)行原核表達(dá)，用表達(dá)產(chǎn)物免疫BALB/。小鼠，獲得了單克隆抗體，該抗體具有很高的特異性。Ya-Leichen等研究發(fā)現(xiàn)，針對P42蛋白的單抗能夠抑制MHYo的生長繁殖。
Jochen等研究發(fā)現(xiàn)了保守脂蛋白呱p378，將其表達(dá)為重組GST融合蛋白，作為包被抗原和豬陽性血清反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)Mhp378只和抗MHYO的陽性血清反應(yīng)，推斷該蛋白為種特異性蛋白。砒p366蛋白，Meens等鑒定出一種能和康復(fù)期豬血清強(qiáng)烈反應(yīng)的蛋白Mhp3，該蛋白不和疫苗免疫豬的血清反應(yīng)。因此，Mhp366是第一個(gè)被鑒定的可以用于診斷包括免疫豬群的MHYO感染的抗原蛋白。此外，Paul等鑒定了至少5種抗原蛋白，包括4種新蛋白:熱休克蛋白70、延伸因子Tu、丙酮酸脫氫酶El一p亞基和膜蛋白P76。
