熊煒 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
1.DNA探針技術(shù)
DNA探針技術(shù)是一種較早被建立的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。 1989年，Stemke將 MHYODNA的Ec0RI酶切片段克隆M13mp19，用重組產(chǎn)物作為探針檢測(cè)MHYO。該方法敏感性高，特異性弱，與絮狀支原體有交叉反應(yīng)。Ahrens等用355標(biāo)記MHYo基因文庫(kù)中一個(gè)1.3kb的DNA片段，作為探針通過點(diǎn)雜交檢測(cè)感染牛和豬的支原體，檢測(cè)結(jié)果顯示，該探針具有特異性。Futo等用32P標(biāo)記與MHYo:洲A互補(bǔ)的寡聚脫氧核普酸制作DNA探針，檢測(cè)了BALF和病肺組織等樣本，其敏感性和特異性都很高，其敏感性比放射性同位素測(cè)定法高10倍。根據(jù)MHYo的16srRNA可變區(qū)序列，Johansson等設(shè)計(jì)出與之互補(bǔ)的特異性寡聚核普酸探針，然后用斑點(diǎn)雜交檢測(cè)感染豬的肺組織中的MHYo。Kwon等用PeR擴(kuò)增出長(zhǎng)度為 520bp的DNA重復(fù)序列作為探針，采用地高辛標(biāo)記后，以組織原位雜交法檢測(cè)了自然感染MHYo豬的肺組織，該方法可以檢測(cè)出病豬體內(nèi)MHYo的分布情況。Boye等用熒光寡聚核昔酸探針對(duì) 165核糖體DNA進(jìn)行定位，對(duì)豬鼻支原體、MHYO和豬滑液支原體進(jìn)行種特異性鑒定。但是，用原位雜交法進(jìn)行檢測(cè)需要?jiǎng)游锏钠式鈽颖荆⑶覚z測(cè)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，不適用于快速診斷，所以在日常獸醫(yī)診斷中應(yīng)用不算十分廣泛。
2.PCR技術(shù)
PcR技術(shù)不但可以克服支原體培養(yǎng)難度大，血清學(xué)技術(shù)易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的缺點(diǎn)，還具有省時(shí)、特異性強(qiáng)、敏感性高和成本低等特點(diǎn)。多種PCR檢測(cè)方法已被建立。早在1985年，Stemke等以MIYo16srRNA基因的一部分作目標(biāo)序列，成功建立了直接PeR。隨后Harasawa等報(bào)道，合成MHYo重復(fù)未知序列的引物，通過PCR擴(kuò)增出520bP的目的片段，用合成的寡核普酸探針與擴(kuò)增出的DNA進(jìn)行印跡雜交鑒定，發(fā)現(xiàn)該P(yáng)CR具有特異性，檢測(cè)閡值為sng或1000CFU/ml，但是該研究沒有對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。
Artiushin等用根據(jù)MHYo獨(dú)特的假設(shè)基因設(shè)計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增456bP的目的片段，以該法對(duì)自然感染豬的鼻拭子和人工感染豬的氣管分泌液、病變肺組織進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)閡值為1一10PgDNA。Stemke等以16SrRNA基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物為20ObP的引物，檢測(cè)閡值為1000基因組，未對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。Mattsson等以MHYO的 16srRNA基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增片段為649bp，用該引物對(duì)感染豬的鼻拭子進(jìn)行PCR檢測(cè)。Blanehard等以假定的ABe運(yùn)載體基因?yàn)槟康幕颍O(shè)計(jì)產(chǎn)物為156lbp的引物，提高了PCR檢測(cè)的敏感性，檢測(cè)閡值為500fg提純的DNA，并檢測(cè)了氣管支氣管洗液中的MHYo。
1997年，stemke等建立了一種用于MHYo檢測(cè)的套式PCR，能直接檢測(cè)出亞臨床感染豬肺中的MHYO，其敏感性提高到相當(dāng)于一個(gè)MHYo的DNA。 stark建立新的套式PcR，并第一次成功地從試驗(yàn)和田間條件下的空氣樣品中檢測(cè)出MHYo。Banmeiste:等用嗅化十六烷基三甲錢法從豬的BALF中提取DNA用于PcR，該方法不僅特異性強(qiáng)，而且敏感性高，適于檢測(cè)活豬呼吸道內(nèi)的MHYO，不能培養(yǎng)的MHYO菌株也可用這種方法進(jìn)行檢測(cè)，因此，能迅速和可靠地獲取一個(gè)豬群MHYo流行病學(xué)的資料。verdin等建立了一種套式PCR，用于檢測(cè)活豬氣管和支氣管洗出液中的MHYO，發(fā)現(xiàn)所有MHYO毒株都能用這種套式PCR進(jìn)行檢測(cè)，和從呼吸道分離的其它病原沒有交叉反應(yīng)，檢測(cè)閡值lfg。
eazsamigzia等用套式PeR檢測(cè)支氣管拭子中的MHYO，并對(duì)檢出率與EP樣肺部損傷之間的關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩者有顯著的相關(guān)性。earon等根據(jù)MHYo的基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增產(chǎn)物分別為948bp和580bP，檢測(cè)了鼻拭子、BALF和肺組織，檢測(cè)閡值分別為到soPg和o.sngDNA，并且還用兩對(duì)引物進(jìn)行了多重PcR擴(kuò)增。
2002年，Kruth等以獨(dú)特的假設(shè)基因序列設(shè)計(jì)引物，通過套式PCR擴(kuò)增出240bP的產(chǎn)物，檢測(cè)了氣管一支氣管洗液和支氣管肺泡洗液中的豬肺炎支原體，檢測(cè)閉值為0.5-1。2004年，Dubosson等通過巢式分別擴(kuò)增MHYPI一03一950重復(fù)序列和1-141片段假定ABC運(yùn)載體基因的部分序列，產(chǎn)物為808bp和706bP，對(duì)支氣管拭子進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)閉值為lfg[9，]。2006年，st砍enbo筆等以多重PeR擴(kuò)增豬肺炎支原體16SrRNA基因，產(chǎn)物為l000bp，靈敏度達(dá)lpg，但未檢測(cè)臨床樣品。2007年，eai等用標(biāo)準(zhǔn)PeR擴(kuò)增16sl.RNA基因，產(chǎn)物大小為649bp，對(duì)肺組織進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)閡值為0.18cFu/g。
Castro等對(duì)MHYO的基因組中含有可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列的編碼基因序列進(jìn)行分析，以評(píng)價(jià)其可變的程度、和抗原性之間存在的可能關(guān)系以及作為菌株分型PcR分析基礎(chǔ)的潛能，發(fā)現(xiàn)特征性可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列相對(duì)穩(wěn)定，其大小為菌株特異性的，研究者建立了一種以該序列為基礎(chǔ)的PCR，用于菌株鑒定、EP的診斷、菌株分型和區(qū)分免疫動(dòng)物中的流行野毒豬與疫苗株。Mayo:等建立多位點(diǎn)序列分型用于分析豬肺炎支原體，結(jié)果顯示，受感染的農(nóng)場(chǎng)都只和一個(gè)MHYO克隆有關(guān)，并且大多數(shù)情況下農(nóng)場(chǎng)之間存在不同克隆，但是地理位置相近或有接觸的農(nóng)場(chǎng)的克隆一致。
群體分析表明，豬肺炎支原體有重組現(xiàn)象，在分析毒株的有限克隆中表現(xiàn)出明顯的多樣性。用基因adk、rPoB和tiPA對(duì)MHYO進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型似乎足以從臨床樣本裂解液直接擴(kuò)增目的基因以進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，而不需要進(jìn)行菌株分離。此外，Artiushin等用隨機(jī)引物PcR分析野毒株時(shí)發(fā)現(xiàn)該P(yáng)CR可用于強(qiáng)弱毒株的區(qū)分，可用于區(qū)分強(qiáng)弱毒株的基因已被證實(shí)。
