熊俊 四川農(nóng)業(yè)大學
沙門氏菌屬是一群寄生于人或動物腸道內(nèi)的革蘭氏陰性、無芽抱的直桿菌，可分為腸道沙門氏菌和邦戈爾沙門氏菌。迄今為止己報道了約2500個血清型，其中大多數(shù)為腸道沙門氏菌，僅有少數(shù)血清型屬于邦戈爾沙門氏菌。根據(jù)其對宿主適應性和嗜性的不同，可將腸道沙門氏菌分成3個群:第一群具有專嗜性和高度適應性，所屬菌的種類較少，如雞白痢和雞傷寒沙門氏菌等;第二群具有偏嗜性，在一定程度上適應于特定動物，該群所含血清型較少，如豬霍亂和都柏林沙門氏菌等;第三個群具有非適應性和泛嗜性，該群具有廣泛的感染宿主，如鼠傷寒沙門氏菌等，能引起人和多種動物的沙門氏菌病。該群在醫(yī)學、獸醫(yī)學和公共衛(wèi)生中具有十分重要的意義。沙門氏菌屬于兼性胞內(nèi)菌，通常寄居在細胞內(nèi)，也可在體外無活細胞的培養(yǎng)基中生長。這樣的特性，為其作為運送載體，將質(zhì)粒運送至機體細胞內(nèi)提供了可能。
1 沙門氏菌的基因缺失減毒
沙門氏菌均具有一定的致病性，若要成為疫苗載體必須具有良好的安全性，因此改造沙門氏菌，使其毒性降低是其作為疫苗載體的先決條件。通過基因工程技術，鑒定出了沙門氏菌毒力基因，并將其缺失，毒力大大降低，使其在宿主體內(nèi)只能有限增殖。一些多基因缺失株，發(fā)生回復突變的可能更是十分微小，安全性得到很好的保證，達到了作為疫苗載體的基本要求。
2 aro基因缺失
沙門氏菌aroA、ar0C、ar0D基因分別編碼3-磷酸莽草酸-1-梭乙烯基轉(zhuǎn)移酶、分支酸合酶、3-脫氫奎寧酸脫水酶。它們控制對細菌生長起著重要作用的一些芳香族氨基酸的生物合成。aro基因缺失菌在體外培養(yǎng)時依賴培養(yǎng)基中含有的這些化合物生長，而缺失株在宿主體內(nèi)獲得這些化合物的可能性極小，只能有限增殖，從而起到減毒的作用。Hoiseth等采用Tnlo轉(zhuǎn)座子隨機插入法，首先將野生型鼠傷寒沙門氏菌的aroA基因缺損，構(gòu)建成為減毒鼠傷寒沙門氏菌SL7207。目前該細菌已被廣泛應用于攜帶DNA疫苗以及作為外源抗原基因的表達宿主菌。Hone等缺失了野生型傷寒沙門氏菌TyZ、xsP1820aroC、aroD雙基因，分別構(gòu)建成為減毒沙門氏菌菌株eoVgos和eDvgo6。ehat6eld等缺失了野生型傷寒沙門氏菌TyZ的aroA、aroe雙基因缺失株。這些雙基因缺失株大大降低了沙門氏菌的毒力，并且減少了菌株毒力回復的可能性。
3 asd基因缺失
沙門氏菌asd基因編碼天冬氨酸乃半乳糖脫氫酶，該酶在細菌合成二氨基庚二酸(DAP)中起著重要作用。DAP為革蘭氏陰性菌細胞壁主要成分肚聚糖中四膚側(cè)鏈的一個組分，DAP的缺失直接影響到細菌細胞壁的完整性，導致細菌死亡。在哺乳動物體內(nèi)和普通培養(yǎng)基中均不含DAP，因此asd基因缺陷的菌株無法在不含DAP的培養(yǎng)基或動物機體內(nèi)正常生長?；诖耍琋akayama等剛]成功構(gòu)建了沙門氏菌的平衡至死系統(tǒng)，將asd基因替代抗性基因克隆到原核表達質(zhì)粒中作為篩選標記，將重組質(zhì)粒導入asd基因缺陷的菌株，通過基因互補效應使得質(zhì)粒穩(wěn)定存在于菌株中。平衡致死系統(tǒng)不使用抗性基因進行篩選，解決了菌體在宿主體內(nèi)無抗生素環(huán)境下質(zhì)粒丟失的問題，還避免了帶有耐藥基因的質(zhì)粒將抗性基因轉(zhuǎn)移給其他菌群的可能性，大大提高了質(zhì)粒使用的安全性。
4 攜帶DNA疫苗的減毒沙門氏菌作為運送載體
沙門氏菌作為一種胞內(nèi)菌能夠通過吞噬泡進入細胞內(nèi)部，進而為質(zhì)粒的釋放提供可能性。但減毒沙門氏菌荷載的質(zhì)粒DNA是如何離開吞噬泡而進入胞液的，目前對這一機制目前尚不完全明了。在早期的研究中，人們認為吞噬泡內(nèi)細菌因營養(yǎng)缺陷而死亡裂解后釋放出的質(zhì)粒DNA可能通過滲漏的方式從吞噬泡進入細胞質(zhì)中。隨后的研究中，人們認為也很有可能與細菌自身的特定轉(zhuǎn)運機制有關系，如在一些革蘭氏陰性菌中存在的111型分泌系統(tǒng)，可將菌體蛋白注入細胞質(zhì)中，同樣的機制也可能用于使質(zhì)粒DNA穿過溶酶體膜進入細胞質(zhì)。在體外試驗中，不具有逃離吞噬泡功能的重組沙門氏菌可直接呈送質(zhì)粒不具有逃離吞噬泡功能的重組沙門氏菌可將質(zhì)粒DNA傳遞給腹腔原代巨噬細胞和樹突細胞，而對于離體培養(yǎng)的細胞系，這種傳遞效率則極為低下。因此研究者認為，在不同的細菌與細胞之間很有可能存在特定的通道進行物質(zhì)從溶酶體到細胞質(zhì)的傳遞。
與肌肉注射DNA疫苗的免疫途徑相比較，通過口服以減毒沙門氏菌為DNA疫苗載體的免疫方式具有許多的優(yōu)勢。首先，它具有抗原呈遞的高效性。DNA疫苗通過肌肉注射或基因槍技術只能使極少量的質(zhì)粒被APC細胞捕獲，而通過減毒沙門氏菌運送的DNA疫苗能特異地將質(zhì)粒DNA靶向傳遞紛相關免疫器官的APCs內(nèi)，而后者比前者具有更強的抗原遞呈作用。其次，減毒沙門氏菌本身可作為一種免疫佐劑，起到增強誘導勃膜免疫的應答的能力。類脂A是沙門氏菌的LPS的主要成份之一，可刺激宿主細胞釋放多種細胞因子，提高機體的免疫應答。以細菌為載體的DNA免疫可采用口服、滴鼻等途徑進行免疫，方便疫苗的群體接種，同時刺激產(chǎn)生粘膜免疫能有效阻止病原在粘膜表面的定居以及入侵。最后，攜帶DNA疫苗的細菌侵入宿主后，在一段時間內(nèi)有限增殖，具有持續(xù)刺激機體，誘導產(chǎn)生抗體的作用。
