肖文 華中農業(yè)大學
1核酸探針雜交技術
核酸探針是通過PCR擴增法、隨機引物法或缺口平移等方法將特定的標記物標記至某特定的核普酸序列上，然后與核酸樣品進行雜交，通過顯示系統(tǒng)來檢測把序列。TGEV的放射性探針雜交法是利用放射性同位素標記的一段反轉后的cDNA與病毒的n1RNA進行特異性結合的原理。Benfield等建立了核酸探針來檢測TGEV的斑點雜交(DotBlot)法。結果與電子顯微鏡檢測以及免疫熒光試驗的結果相似性很高，由此證明放射性探針雜交法具有很高的靈敏性以及特異性。但由于放射性物質對人，對環(huán)境都具有很大的傷害，因此，近年來利用非放射性標記物來標記核酸探針，且已被廣泛的應用到獸醫(yī)研究中。但非放射性探針同樣具有不足之處，它的靈敏性以及特異性等都不如放射性標記物標記的探針。
2免疫膠體金標記技術
膠體金是由氯金酸(HAuC14)在還原劑(如構椽酸鈉，鞭酸等)的作用下，聚合成特定大小(1一150nm)的金顆粒，然后由于相互靜電作用形成穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。免疫膠體金技術則是以該膠體金做為一個示蹤物質，將其應用于抗原抗體的一種新型標記技術。由于膠體金在相對弱堿環(huán)境中帶負電荷，而其他許多大分子物質如蛋白質等帶正電荷，因此膠體金與大分子物質牢固結合，并且由于是靜電結合，所以也不影響生物大分子特性，從而使它成為免疫反應中很好的標記物，因此廣泛應用于免疫學，組織病理學等生物學領域。
3 PCR技術
PCR法是目前實驗室最常用的一種檢測方法，能夠檢測出樣本中微量的核酸，具有多種優(yōu)點。對于TGEv，包含有RT-PCR、套式RT-PCR、多重RT-PCR等。對于TGEV，RT-PCR是一種特異強且敏感性高的診斷方法，英國P歌on以及李軍等用建立的RT-PCR方法與夾心ELISA法作對比，結果表明RT-PCR法敏感性更高。該方法具有操作性簡便，適用于大批量的臨床樣本檢驗，該方法對于TGEv的檢測診斷以及流行病學的調查中具有重要意義。
套式RT-PCR原理是針對DNA模版設計兩對特異性的引物，外引物和內引物，首先以外引物擴增目的片段，然后以該擴增產物為模版，利用內引物再次擴增，從而提高擴增效率。該方法的敏感性比普通RT-PCR更強。
多重RT-PCR是指在同一反應體系中加入2對及以上的引物，針對不同的引物，能夠同時擴增出不同的核酸片段的Rl飛PCR反應。該方法能夠同時檢測多種病原微生物具有高效性而且更加的經濟簡便性，同時也具有普通Rl-PCR的高敏感性等多種特點。KimO于2000年運用多重RT-PCR方法對腹瀉的斷奶前仔豬進行PEDV和TGEv的檢測，表明該方法能直接檢測糞便或者腸道組織樣本。2010年，張坤建立了一種能夠同時檢測PEDV、TGEV、GAR三種引起腹瀉的病毒的多重RT-PcR。但這種方法一般只適用于一種核酸類型的病毒。
