付衍輝 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
1.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGFA)
獸醫(yī)發(fā)現(xiàn)在卵泡閉鎖的過(guò)程中，也許是由于卵泡血液供應(yīng)不足，導(dǎo)致卵泡發(fā)生閉鎖。已知VEGFA能增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管生成，同時(shí)維持血正常的功能。當(dāng)vEGFA作用于毛細(xì)血管的小靜脈和尾靜脈，使血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性增強(qiáng)，促使溢出血管外的蛋白凝集，蛋白凝結(jié)可作為血管形成的基質(zhì)，同時(shí)伴隨間質(zhì)細(xì)胞成熟基質(zhì)的進(jìn)一步形成，從而促進(jìn)新生血管的形成。在卵泡閉鎖的過(guò)程對(duì)vEGF表達(dá)量的研究，將有利于對(duì)卵泡閉鎖機(jī)制的進(jìn)一步闡明。
2.胞間連接蛋白基因 (Cx43)
哺乳動(dòng)物卵泡顆粒細(xì)胞以縫隙連接和豁著小帶兩種方式進(jìn)行連接，其中縫隙連接蛋白Cx43主要定位于卵泡顆粒細(xì)胞，當(dāng)卵泡中缺失Cx43時(shí)，顆粒細(xì)胞中DNA合成量減少，顆粒細(xì)胞凋亡，卵泡閉鎖。薪著小帶也是由顆粒細(xì)胞合成的一種N一鈣勃素粘合而成的，具有調(diào)控顆粒細(xì)胞聚散的作用。這兩種顆粒細(xì)胞間的連接均可以阻止顆粒細(xì)胞的凋亡。
3.CYPIAI
CYP1Al是細(xì)胞色素P45O酶系中的一種重要代謝酶，并能夠代謝雌激素，產(chǎn)生多種化學(xué)活性中間體，化學(xué)活性中間體生成相應(yīng)的雌激素代謝產(chǎn)物，雌激素水平的降低，將會(huì)導(dǎo)致卵泡閉鎖進(jìn)程的加快。
4.easpase基因
Caspase為半膚氨酸酶蛋白類(lèi)，在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起到重要作用。研究表明，CasPase凋亡途徑參與了卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的過(guò)程，并且CasPase一3是關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行分子，在多種凋亡信號(hào)的導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用。Caspase一3正常時(shí)是以酶原的形式存在的，在細(xì)胞凋亡早期被激活，激活后的Caspase一3將引起一系列的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。
CasPase在哺乳動(dòng)物卵泡顆粒細(xì)胞發(fā)揮的凋亡作用有以下幾個(gè)特點(diǎn):1)作為一種半膚氨酸蛋白酶，是以半膚氨酸作為裂解底物的親核基團(tuán);2)Caspase的催化活性只能針對(duì)特異的天冬氨酸底物 ;3)Caspase正常時(shí)以活性很低的酶原形式存在的，當(dāng)?shù)鞍酌杆獾舭被┒说囊欢涡蛄泻髮⒈患せ睿藭r(shí)才具有執(zhí)行細(xì)胞凋亡的功能;4)活化的caspas。將特異的水解底物，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且這個(gè)過(guò)程是不可逆的;5)正常情況下，細(xì)胞內(nèi)有Caspase的抑制劑，以防止Caspas。酶原被偶然激活而對(duì)正常的細(xì)胞造成損傷。
5.白細(xì)胞介素(IL一1)
IL一1是一種參與卵巢內(nèi)多種生化反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子，同時(shí)也是一種抗卵泡閉鎖的因子。IL一lp主要抑制由卵泡顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的IGFBP一4和5，并且IL一lp擷抗劑的存在將消除IL一lp對(duì)IGFBP的抑制作用。IL一lp通過(guò)與特異受體結(jié)合，抑制IGFBP一4和5的轉(zhuǎn)錄，從而就抑制了IGFBPs蛋白的積累，同時(shí)提高對(duì)IGFBPs蛋白分解酶的活性。lL一lp抑制IGFBPs蛋白的積累是由于降低了相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄效率，并沒(méi)有改變IGFBPs蛋白的穩(wěn)定性，因此IL一lp是一個(gè)調(diào)控卵泡閉鎖的重要基因。
6.p53基因
P53在正常生長(zhǎng)的細(xì)胞內(nèi)起著重要的調(diào)控作用，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化，其蛋白能特異的DNA序列結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄，且Egr-1能促進(jìn)p53基因的表達(dá)。p53作為一個(gè)促細(xì)胞凋亡基因，許多凋亡因子依賴p53的激活來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，并能與Bcl一2家族凋亡和抗凋亡作用介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡途徑，在卵泡中通過(guò)線粒體途徑促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡。
7.Foxol基因
Foxol是一種促細(xì)胞凋亡因子，在細(xì)胞正常的凋亡和癌變中都起到重要作用，研究發(fā)現(xiàn)Foxol基因表達(dá)量在閉鎖卵泡中升高。Foxol能夠刺激Bd一2家族中促凋亡基因Bim基因的表達(dá)。在不同的細(xì)胞類(lèi)型中，F(xiàn)oxol可以激活不同的基因，當(dāng)不同的基因被激活以后，能夠引起細(xì)胞的凋亡或不凋亡，導(dǎo)致這種結(jié)果的可能的原因是Foxol的轉(zhuǎn)錄活性及其調(diào)控的靶基因受到不同細(xì)胞類(lèi)型微環(huán)境的影響。
Foxol主要通過(guò)Bim和FasL兩個(gè)途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡，其發(fā)揮作用的一個(gè)重要途徑是直接集合到目的DNA上，進(jìn)而影響靶基因的轉(zhuǎn)錄水平，當(dāng)Foxol轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到細(xì)胞核內(nèi)的DNA上時(shí)，可以激發(fā)凋亡促進(jìn)因子FasL，進(jìn)一步通過(guò) Fas/FasL受體細(xì)胞凋亡系統(tǒng)發(fā)揮促凋亡作用。而Akt可以通磷酸化胞質(zhì)內(nèi)的Foxol阻止其進(jìn)入胞核內(nèi)誘導(dǎo)相關(guān)凋亡因子的轉(zhuǎn)錄，并且Akt只能對(duì)胞質(zhì)內(nèi)的Foxol磷酸化，而不能進(jìn)入胞核將Foxol磷酸化。
8.Bd一2家族基因
細(xì)胞凋亡的新號(hào)通路主要包括線粒體凋亡通路和死亡受體介導(dǎo)的凋亡通路，并且這兩條通路最終通過(guò)激活caspase介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。
在線粒體凋亡通路中，線粒體結(jié)構(gòu)和功能的變化，如:線粒體膜通透孔(mito一chon drialperme曲 ilizationtransitionpore，MPT)的形成、線粒體膜電位的降低和細(xì)胞色素e的釋放是細(xì)胞在線粒體凋亡通路中的一個(gè)主要特征。
Bd一2家族成員在線粒體凋亡通路中發(fā)揮了重要作用。Bcl一2家族是由抗凋亡和促凋亡成員組成的，各成員之間通過(guò)相互協(xié)調(diào)作用對(duì)線粒體的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行調(diào)控，控制線粒體促凋亡因子、誘導(dǎo)凋亡因子和細(xì)胞色素e的釋放等決定細(xì)胞的凋亡。在Bd一2家族促凋亡的過(guò)程中，僅含 BH3(BH3一only)結(jié)構(gòu)域的促凋亡成員發(fā)揮了決定性作用Bl一2蛋白家族成員具有Bel一2同源結(jié)構(gòu)域，有的蛋白成員含有BHI一BH4結(jié)構(gòu)域，而有的只含有一個(gè)或幾個(gè)這樣的結(jié)構(gòu)域，這種在結(jié)構(gòu)域上的不同，使得Bcl一2家族成員蛋白具有不同的生物學(xué)功能。
Bcl一2家族中的抗凋亡成員Bcl一2、Mel一1.、Bcl一XL、Bel一W等都包含四個(gè)結(jié)構(gòu)域 (BHl一BH4)和一個(gè)跨膜(TM)結(jié)構(gòu)域，這樣的結(jié)構(gòu)使這些成員定位于線粒體外膜，部分也能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的表面，其蛋白的跨膜立體結(jié)構(gòu)朝向胞質(zhì)，這些成員蛋白能都使細(xì)胞免于死亡。而缺少BH4結(jié)構(gòu)域的成員均具有促細(xì)胞凋亡的活性，如Bax、Bak等。BH3結(jié)構(gòu)域是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性結(jié)構(gòu)域，也是促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白作用形成二聚體所必須的，通常此結(jié)構(gòu)域的氨基酸進(jìn)行修飾，特別是磷酸化修飾后可以影響其促凋亡作用的發(fā)揮。B1一2家族中抗凋亡蛋白和凋亡蛋白的作用機(jī)制:一般式抗凋亡蛋白的BHI、BHZ和BH3三個(gè)結(jié)構(gòu)域形成一個(gè)伸長(zhǎng)的疏水口袋，凋亡蛋白的BH3作為一個(gè)兩性螺旋結(jié)構(gòu)與其結(jié)合，在這個(gè)過(guò)程中抗凋亡蛋白的BH4結(jié)構(gòu)域能夠穩(wěn)定這種結(jié)合作用，通過(guò)這種結(jié)合方式可以使得BH3結(jié)構(gòu)域被覆蓋，此時(shí)凋亡蛋白不能發(fā)揮其促凋亡作用。
Bd一2家族蛋白凋亡機(jī)制:Bcl一2家族促凋亡蛋白大部分定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞骨架，接受死亡信號(hào)的刺激以后，蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，整合到線粒體外膜上。在這一過(guò)程中，促凋亡蛋白也會(huì)伴隨相應(yīng)的變化:Bad和Bid磷酸化調(diào)節(jié)、典型的Bax構(gòu)象變化和Bid、Bim的蛋白裂解效應(yīng)等，最后會(huì)使線粒體的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化(如上所述)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。
l)構(gòu)象的改變和凋亡:Bcl一2家族成員能夠形成同源或異源二聚體，可以單獨(dú)也可以協(xié)同發(fā)揮細(xì)凋亡作用，如促凋亡蛋白Bax通常以單體的形式存在于胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞接受死亡信號(hào)后，Bax的構(gòu)象發(fā)生改變，還有一些僅含BH3結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白(Bad、Bik)可以和Bcl一2蛋白結(jié)合而拮抗Bd一2的抗凋亡作用，此時(shí)Bid和Bim可以直接激活Bax，激活后的Bax轉(zhuǎn)移到線粒體外膜形成同源二聚體蛋白通道，這種蛋白通道可以促進(jìn)細(xì)胞色素c的釋放，進(jìn)而是caspase的激活和細(xì)胞凋亡;
2)磷酸化和凋亡:僅含BH3結(jié)構(gòu)域的Bad促凋亡功能的實(shí)現(xiàn)通過(guò)某些磷酸化位點(diǎn)的磷酸化調(diào)控實(shí)現(xiàn)的，非磷酸化的具有生物活性的Bad與Bd一2或Bcl一XL相互作用，在抑制這兩種蛋白的抗凋亡功能的同時(shí)發(fā)揮了自身的促凋亡作用。對(duì)于僅含有BH3結(jié)構(gòu)域的Bik，如果其磷酸化位點(diǎn)發(fā)生突變將導(dǎo)致無(wú)法進(jìn)行磷酸化，此時(shí)Bik的促凋亡作用降低或喪失。所以磷酸化對(duì)于細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)具有雙向作用;
3)斷裂效應(yīng)與凋亡:斷裂是另一種激活促凋亡的方式，其中最典型就是Bid對(duì)于死亡受體的應(yīng)答就是這種機(jī)制的作用，在這種機(jī)制中，死亡受體激活的Caspase一8可以使存在于胞漿中的非活性的Bid斷裂為具有生物活性的tBidls，并轉(zhuǎn)移到線粒體上面，進(jìn)而增加了線粒體的通透性。還有另一種說(shuō)法是:斷裂后形成的tBid能夠激活Bak/Bax傳遞的凋亡信號(hào)到線粒體，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞色素c的釋放和下游的caspase級(jí)聯(lián)凋亡反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞的死亡。Bim作為一種促凋亡蛋白，廣泛存在于T和B淋巴細(xì)胞中，Bim的一種剪切體BimEL以磷酸化和非磷酸化兩種形式存在于T細(xì)胞中，非磷酸化的BimEL存在微管中并呈現(xiàn)失活狀態(tài)，而磷酸化的pBimEL可以從微管上釋放出來(lái)，激活的caspase可以將pBimEL斷裂為tBimEL，進(jìn)而激活死亡受體凋亡途徑或死亡受體凋亡途徑。
線粒體凋亡通路受到Bd一2家族蛋白的精密調(diào)控，線粒體外膜的通透性被抗凋亡成員蛋白抑制，而促凋亡成員Bak和Bax構(gòu)象的改變能夠促進(jìn)細(xì)胞色素c的釋放。Bad和Bik通過(guò)磷酸化途徑調(diào)節(jié)自身的促凋亡活性，僅含BH3結(jié)構(gòu)域的Bid和Bim的蛋白裂解效應(yīng)能夠間接或直接的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bcl一2家族成員促凋亡的機(jī)制是誘導(dǎo)線粒體膜通透性的改變，尤其是對(duì)跨膜蛋白細(xì)胞色素c通透性的增加，一旦細(xì)胞色素c釋放，即能激發(fā)下游的Caspase級(jí)聯(lián)凋亡反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
